《生物化学》第12章 DNA的复制、修复与重组DNA技术-教学课件（非AI生成）.ppt

********************************************3、常用工具酶限制性内切酶(restrictionendonuclease)DNA连接酶逆转录酶S1核酸酶(切单链DNA/RNA)碱性磷酸酶末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)*限制性内切酶(restrictionenzyme

或restrictionendonuclease）限制性内切酶是微生物的一种自我保护酶，它能识别双链DNA分子中某一段特异碱基序列并切开。识别的DNA序列多数为4－6个碱基，也有8个碱基的。识别序列都具有回文结构的特点。“分子手术刀”*“分子剪刀”的发现者*命名原则：EcoRⅠ

细菌属名种名株系编号 识别DNA序列的碱基数：4—6个切除机率多8个切除机率少分析大片段DNA识别序列：回文/双重对称结构切口：粘性末端平端末端*限制性内切酶切口有两种：

1.粘性末端(cohesiveend或stickyend)

2.平端末端(bluntend)

★平末端（bluntend)

在识别顺序的对称轴上，对双链DNA同时切割。

HpaIHpaI

5’GTTAAC3’5’GTT+AAC3’

3’CAATTG5’3’CAATTG5’

*★5’端粘性末端（cohesiveend)

在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的5’末端切割。

EcoRI

EcoRI

5’GAATTC3’5’G+pAATTC3’

3’CTTAAG5’3’CTTAAp+G5’

*

★3’端粘性末端

在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的3’末端切割。

PstI

PstI

5’CTGCAG3’5’CTGCA+pG3’

3’GACGTC5’3’GpACGTC5’

*粘性末端拼接法图12-25*分类及作用:I型、II型、III型

II型酶的识别

识别序列一般为4-6个碱基对，

具有回文结构。

*II型限制酶的用途

（1）构建DNA重组体、克隆及亚克隆

（2）DNA杂交与序列分析

（3）改建质粒

（4）构建基因组DNA物理图谱和文库等

*（一）原核细胞转化作用（transformation）：以改变细胞的通透性，将重组DNA分子，引入原核细胞，如大肠杆菌，使其在细菌体内扩增及表达的过程。

三、重组DNA分子引入宿主细胞感染（infection）：以噬菌体为载体的重组DNA分子，经体外包装成具有感染性噬菌体，可感染合适的大肠杆菌，使其在细菌内繁殖。*（二）动物细胞转染作用（transfection）：用磷酸钙使外源DNA形成沉淀颗粒，颗粒沉着在动物细胞的表面，可被细胞摄取，而改变细胞的性质。微注射法（microinjection）：将外源DNA分子直接注入细胞或核内。

*转基因（transgenic）：将重组DNA分子注射入单细胞受精卵的核内，使子代的全身各组织细胞都含有DNA，研究整体条件下外源DNA的功能。

*四、筛选(一)转化细菌的筛选含有重组质粒DNA菌落的选择，主要是根据抗药性标志(二)噬菌体的筛选常根据噬菌体所含的LacZ基因是否被插入片段破坏来筛选*(三)菌落或噬菌斑原位斑点杂交(四)蛋白质表达产物的测定可用放射免疫方法来筛选*抗药性标志外源DNA片段插入pBR322的P