《细胞与分子生物学实验》04醋酸纤维素薄膜电泳-教学课件（非AI生成）.ppt

生物化学4、电泳技术（实验1）5、层析技术（实验5、6）6，7、分光光度法（实验13、p101、p133）离心技术（p37）分子生物学8，9、（p111、实验15）*血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳——根据迁移率分离*操作步骤标记用铅笔在薄膜无光泽面(毛面)一端2cm处轻画一细线，并在右上角做好标记。浸泡将醋酸纤维素薄膜毛面向下，在缓冲溶液中浸泡，使其充分浸透。点样用镊子将薄膜置于滤纸上，吸收多余的液体(不要太干），利用载玻片一侧蘸取样品，45度角于毛面细线处点样。电泳将薄膜毛面朝下，置于电泳槽的纱布桥上，点样端置于负极；膜条紧贴纱布，待平衡5min后通电，在U=120V电泳40min。染色将薄膜取出后，置于氨基黑10B染色剂中，染色5min。漂洗将薄膜取出后，移至漂洗液中，漂洗若干次，滤纸吸干。*电泳技术发展概念基本原理影响因素种类应用*

TheNobelPrizeinChemistry1948

Arne?Tiselius1808年-----俄国物理学家Re?ss发现电泳现象。1937年-----瑞典科学家Tiselius首先设计出世界上第一台自由电泳仪，并建立了“移界电泳”分离模式。以电泳作为一种分离技术，首先证明了血清蛋白是由白蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白组成的。forhisresearchonelectrophoresisandadsorptionanalysis,especiallyforhisdiscoveriesconcerningthecomplexnatureoftheserumproteins*发展20世纪50年代，以支持介质为主的电泳模式不断涌现，如滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉薄膜等。60年代以后发展了以凝胶为主的支持物的电泳方法，如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶电泳等。1967年在凝胶电泳的基础上建立了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术。90年代又推出了分辨率极高的高效毛细管电泳。如今，各类电泳技术已广泛应用于生命科学各个领域。*基本概念带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳(electrophoresis)。带电粒子由于带电性质及电荷量不同，在一定的电场强度下具有不同的移动速度及方向。电泳技术就是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的一类实验技术。*电泳用于分离物质的原理（1）电荷量及方向：蛋白质为例等电点*电泳用于分离物质的原理（2）迁移率：以?来表示，即单位电场强度时粒子运动的速度，取决于带电粒子的电荷量Q、粒子大小γ和形状。*电泳用于分离物质的原理（3）具体实验中：V:泳动速度cm/秒or分d:泳动距离cmt:电泳时间(秒/分)E:电场强度伏特/cmu:泳动率or泳动度(cm2/伏·秒or分)U:电压l:支持场的长度(有效长度)*设：混合物中有A、B两物质：物质A在电场中移动的距离为:dA=?AVt/l

物质B的移动距离为：dB=?BVt/l则两物质移动距离之差为：

Δd=(dA-dB)=(?A-?B)Vt/l

即：物质A、B能否分离取决于两者的迁移率

*影响电泳速度的因素：内因1.净电荷：被分离物带电荷量与电泳速度成正比2.质点大小：颗粒直径愈小愈快，分子大小与电泳速度成反比3.质点形状：球形分子比纤维状分子泳动快。*影响电泳速度的因素：外因（1）溶液的pH值决定带电粒子的解离的程度，即该物质带净电荷多少的决定因素。对蛋白质等两性电解质而言，pH值离等电点越远，则颗粒所带净电荷越多，泳动速度也越快，反之，则越慢。为了使电泳过程中溶液pH值恒定，必须采用缓冲溶液。一般常用的电泳缓冲液pH范围在4.5~9.0。*影响电泳速度的因素：外因（2）溶液的离子强度维持一定的缓冲容量，需要一定浓度的离子，它主要与其浓度和价数相关。I=1/2?CiZi2缓冲液I越大，降低样品（蛋白质）带电量，泳动速度变慢，最后破坏胶体，但区分条带清晰。缓冲液I越小，缓冲容量小，pH不稳定，样品易扩散；则泳动速度快，条带分离差。一般在0.02-0.2。*影响电泳速度的因素：外因（3）