《细胞与分子生物学实验》05层析技术-教学课件（非AI生成）.ppt

结果观察ⅠⅡ缬亮苯丙赖甘丝天脯谷*思考题预习：实验13、P101Biuret法测定蛋白质含量的原理。葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖含量的原理。P10、P12*离子交换层析原理：是一种利用混合物中各物质酸碱度及极性不同，造成它们与离子交换剂不同的结合力而进行分离的一种方法。主要用于可解离电荷的物质。这种分离主要与各种离子所带电荷有关，这种结合主要是带相反电荷的颗粒之间的静电引力。*流动相：洗脱液

NH3RCOOH+NH3RCOO+-RNH2COO-LowpHPositivechargeHighpHNegativechargeHydrogengainedHydrogenlost决定被分离物质带电荷*固定相：离子交换剂↙共价结合平衡离子平衡离子是结合于配基上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。阳离子交换剂：平衡离子带正电的离子交换剂，能与带正电的离子基团发生交换作用阴离子交换剂：平衡离子带负电的离子交换剂，与带负电的离子基团发生交换作用*常用的离子交换剂常用的惰性基质：人工合成树脂（单体：苯乙烯、交联剂：二乙烯苯），人工合成纤维素阳离子交换剂：带有SO3－或COO－基团，阴离子交换剂：带有N＋（C2H5）基团可交换离子：阳离子：Na+、H+阴离子：Cl-、OH-强酸性，聚苯乙烯树脂*离子交换层析的过程离子取代顺序是吸附和洗脱的过程：R-X++Y+R-Y++X+*图示：Cation-exchangecolumn*离子交换层析分离Asp、Gly、LysSO3-H+SO3-H+PH4.2柠檬酸钠SO3-Na+SO3-Na+Asp：PI=2.77Gly：PI=5.97Lys:PI=9.74SO3-Na+SO3-Na+SO3-Gly+SO3-Gly+SO3-Lys+SO3-Lys+PH12NaOHSO3-Na+SO3-Na+*凝胶层析分离鉴定蛋白质DNS—氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析细胞与分子生物学实验层析技术*TheNobelPrizeinChemistry1952“fortheirinventionofpartitionchromatography”分配色谱分析法，用于分离氨基酸混合物中的各种组分，还用于分离类胡萝卜素。ArcherJohnPorterMartinRichardLaurenceMillingtonSynge*MichaelTswett(1872-1919),1906年，俄国植物学家M.Tswett将绿叶石油醚提取液过CaCO3柱并用石油醚洗，色层逐渐分开，证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。1.无色；2.黄色（叶黄素β）；3.深橄榄绿色（β叶绿素）；4.深橄榄绿色（α叶绿素）；5.黄色（叶黄素α’’）；6.黄色（叶黄素α’）；7.黄色(叶黄素α)；8.深灰色层(叶绿素类)固定相(fixedphase)流动相(mobilephase)层析柱(chromatographiccolumn)*层析的原理层析技术是一组相关分离方法的总称，当待分离的混合物随流动相通过固定相时，利用混合物中各组分的物理化学性质间的差异(溶解度、分子极性、分子大小、分子形状、吸附能力、分子亲合力等)，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随流动相向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配，从而达到将各组份分离的目的。*层析中的两相固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。在柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。*层析的分类（1）按固定相基质的形式：柱层析、纸层析和薄层层析*层析的分类（2）气-固层析（gas-solidchromatography）层析液-液层析（liquid-liquidchromatography）气相层析（gas-chromatography）液相层析（liquid-chromatography）气-液层