《细胞与分子生物学实验》09PCR技术检测β-actin基因-教学课件（非AI生成）.ppt

琼脂糖凝胶电泳以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。分离DNA片度大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。在碱性缓冲液中DNA分子带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动*优点：含液体量大，可达98%-99%，近似自由电泳，但是样品扩散度比自由电泳小，对蛋白质吸附极微。作为支持体有均匀，区带整齐，分辨率高，重复性好等优点。电泳速率快。透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪做定量测定。区带易染色，样品易回收，有利于制备。具有良好的生物相容性、显著的稳固性、滞度和滞后性。其优质产品几乎不带有电荷基团，对生物大分子没有吸附作用，是一种理想的惰性载体。*注意事项：使用琼脂糖需要加温，需做好必要的防护措施，避免烫伤。不能将琼脂糖粉末直接倒入沸水中，这样做会引起爆沸，溅出，致使浓度下降，还会造成结块而融化困难。必须保证琼脂糖完全溶解，否则造成电泳条带不清，保证完全溶解的前提下，尽量缩短加热时间。室温凝固后，即可使用。如不立即使用请用保鲜膜封好，4℃冷藏，可保存2-5天。

*凝胶的制备：*琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～32.00.1～2wellsBromophenolBlueCathode(-)Anode(+)Gel示踪剂：溴酚兰2%凝胶中迁移速度≈150bpDNADNA(-)?*溴化乙锭(EB)染色溴化乙锭是一种荧光染料,可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光，DNA分子越小,结合的EB越少,染色越淡CAUTION!Ethidiumbromideisapowerfulmutagenandismoderatelytoxic.Glovesshouldbewornatalltimes.**紫外光下观察*PCR的类型：RT-PCR（ReverseTranscriptase）原位PCR（InSituPCR）实时定量PCR（Real-timePCR）多重PCR（MultiPCR）反向PCR（InvertedPCR）不对称PCR（AsymmetricPCR）锚定PCR（AnchoredPCR）*PCR技术的应用

临床医学方面：PCR检测病原体PCR临床诊断术生命科学领域：特定DNA序列的克隆与重组子的鉴定DNA的体外定点突变与分析同源重组子的检测PCR-SSCP检测基因序列*PCR检测病原体TORCH是一组病原生物的英文名称缩写，即弓形虫（toxoplasmagondii）、其他病原微生物（others）、风疹病毒（rubellavirus）、巨细胞病毒（cytomegalovirus）、单纯疱疹病毒（herpessimplexvirus）第一个英文字母的组合。孕妇感染弓形虫后，除了通过胎盘感染胎儿外，还可经过羊水进入消化道而使胎儿感染。孕妇感染弓形虫后，可造成流产、早产、胎儿小头畸形、脑积水、视力障碍、智力发育缺陷等畸形。PCR：以B1基因、200-300重复序列（AF146527）或16SrDNA为目的基因。*ThePCRSongTherewasatimewhentoamplifyDNA,Youhadtogrowtonsandtonsoftinycells.ThenalongcameaguynamedDr.KaryMullis,Saidyoucanamplifyinvitrojustaswell.Justmixyourtemplatewithabufferandsomeprimers,Nucleotidesandpolymerases,too.Denaturing,annealing,andextending.Wellit’samazingwhatheatingandcoolingandheatingwilldo.PCR,whenyouneedtodetectmutations.PCR,whenyoun