《细胞与分子生物学实验》07AKP的Km测定-教学课件（非AI生成）.ppt

实验结果葡萄糖含量=AU/AS×5.5mmol/L思考题1、还有其他什么方法测定蛋白质含量？2、请用双缩脲法设计一个测定蛋白质含量的定量方法（除标准曲线法外）。3、测定血糖为什么不能使用溶血标本?4、颜色的深浅在一定范围内与血液葡萄糖浓度成正比，这里一定范围指什么？****AKP(碱性磷酸酶)的Km测定——Lineweaver-Burkequation(Hanes-Wolffplot、Eadie-Hofsteeplot)*目的要求1、学习了解米氏常数的意义2、米氏常数测定的原理3、米氏常数的作图4、碱性磷酸酶活性测定的原理和方法*酶促反应动力学：

底物浓度对酶促反应速度的影响1913年TheMichaelis–MentenEquation*学习了解米氏常数的意义Km：米氏常数，是研究酶促反应动力学最重要的常数。物理意义：Km值等于酶反应速度为最大速度一半时的底物浓度。Km值是酶的特征性常数，只与酶的性质有关,其单位为摩尔浓度。Km反映酶和底物的亲和力，Km值大与底物亲和力愈小。Km与底物浓度和酶浓度无关，而受温度和pH值的影响应用：（1）鉴定酶（2）判断酶的最佳底物：最小Km（3）计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最大反应速度的比率（4）测定不同抑制剂对Km的影响*米氏常数测定的原理在温度、pH和酶浓度一定时，酶促反应初速度与底物浓度的关系满足米-曼氏方程式?，Km是酶的特征性常数，反映了酶与特定底物的亲和力大小。Lineweaver和Burk将米氏方程改写成双倒数形式推导米-曼氏方程式可得一直线方程在横坐标上的截距即可算出Km值。实验时选择不同的[S]，测定相对应的V。求出两者的倒数，以1/V对1/[S]作图，则得到一斜率为“Km/Vmax”的直线，在纵轴上的截距为“1/Vmax”。将直线外推与横轴相交，其横轴截距为“-1/Km”。*Km的测定：

Lineweaver-Burk双倒数法

*实验方法：磷酸苯二钠法实验以AKP为目标，选择不同浓度的磷酸苯二钠为AKP的底物，磷酸苯二钠被AKP水解，生成酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用下，经铁氰化钾氧化生成红色醌的衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力的强弱红色醌类化合物*实验步骤1.分A、B组，各取试管8支编号，A组稀释10mmol/L底物液，B组吸取相应的已稀释底物液1.0ml，各加入pH10的碳酸钠缓冲液0.9ml，混匀。组别试剂管号123456789A10mmol/L底物液(ml)—1.01.01.01.01.01.02.01.0蒸馏水(ml)—7.06.05.04.03.02.02.01.0底物液浓度(mmol/L)01.251.431.672.02.53.33510B已稀释的底物液(ml)1.0水1.01.01.01.01.01.0底物pH10碳酸钠缓冲液(ml)0.90.90.90.90.90.90.9*2.再加AKP0.1ml，混匀后立即放入37℃水浴15min。3.各加入0.5mol/LNaOH1.0ml，终止反应，混匀。4.各管中依次加入0.3％4-氨基安替比林1.0ml和0.5％铁氰化钾2.0ml充分混匀，室温放置10min以第一管为对照，波长510nm比色。实验结果记录与分析数值计算和作图：以1/[S]为横坐标，1/A510nm为纵坐标，在方格纸上描点作图，并计算Km值。*底物浓度mmol