《免疫学实验》实验3 小鼠脾单个核细胞的分离— 密度梯度离心法 -教学课件（非AI生成）.ppt

实验三小鼠脾单个核细胞的分离

—密度梯度离心法实验原理：根据物理学中颗粒沉降原理，不同密度的物质颗粒在其沉降运动中可因其密度的差别而处于不同的分布位置。利用此原理可设计一定密度的液体界面，将外周血中各种不同密度的细胞通过离心沉降而达到使其彼此分离的目的。*单个核细胞（PBMC）=淋巴细胞（95%）+单核细胞已知小鼠PBMC的密度约为1.088（人类约为1.077），而红细胞与粒细胞的密度均大于1.088（人类均大于1.090）用密度为1.088±0.001（人类为1.077±0.001）的Ficoll分离液（PBMC密度略低于分离液）则可通过密度梯度离心方法，在分离液界面上收集PBMC。实验原理：*器材：（1）水平式离心机（2）显微镜（3）血球计数板、血盖片（4）试管、滴管（5）定量移液器（6）刻度离心管（7）擦镜纸试剂：（1）小鼠脾脏细胞悬液（2）淋巴细胞分离液（市售，密度：1.088±0.001）（3）生理盐水（0.9%氯化钠注射液）（4）白细胞稀释液（5）0.4%锥兰染液器材与试剂：*操作步骤：将1ml小鼠脾细胞悬液混匀，用滴管沿盛有2ml淋巴细胞分离液的试管壁轻轻铺于分离液面上。将该试管置水平式离心机中离心（1800rpm）15分钟。（一定要平衡）*操作步骤：离心后的各成份在试管中的分布位置如下图：用滴管小心地直接插入白色絮状的细胞层（含PBMC），吸出界面层细胞，移入另一试管内。1.0881.088稀释的悬液稀释的悬液*操作步骤：加入足量生理盐水（N.S），用滴管轻轻上下混匀，然后离心（1000rpm）10分钟，弃去上清液，将沉淀细胞充分摇匀，再用N.S洗涤1次。用0.3mlN.S将沉淀细胞稀释，摇匀。取细胞悬液1滴加入等量白细胞稀释液于另一试管中充分混匀，用计数板在显微镜下计数，计算出单个核细胞浓度（个/ml）。检查细胞活力：取细胞悬液一滴加入等量锥兰溶液于另一试管中充分混匀，用载玻片在显微镜下计数50~100个单个核细胞中着色的死细胞数。*单个核细胞浓度（个/ml）（4大方格细胞总数）4细胞活力（%）实验结果记录与分析分离后活细胞数分离后细胞总数×10×2×103*一大方格=1×1×0.1=0.1mm31?l=1mm31ml=1000mm3*操作注意事项分离液与脾细胞悬液的比例，一般以1:2~1:3为宜。分离时所取的离心速度与时间，因各台离心机的离心半径而异，需事先通过预试验决定。加入脾细胞悬液时应十分小心，注意保护试管内的界面，勿使混淆而影响分离效果。做细胞活力检查时，锥兰染色后应尽快计数完毕，时间过长则细胞活力可能降低。离心温度（过低细胞丢失，过高细胞失活）。*