《细胞与分子生物学实验》06分光光度法-教学课件（非AI生成）.ppt

细胞与分子生物学实验双缩脲法测定蛋白质含量葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖含量分光光度法*分光光度法是根据物质的吸收光谱及光的吸收定律，对物质进行定性、定量分析的一种方法。红外吸收光谱：800nm?500?m。主要用于有机化合物结构鉴定。紫外吸收光谱：200?400nm（近紫外区）,无色物质。可用于结构鉴定和定量分析。可见光：400~700nm,有色物质溶液概念*电磁波谱:以波长大小顺序排列的电磁波谱图

波长10pm300pm200nm400nm750nm500mm1cm1m光谱?射线X射线紫外光可见光红外光微波无线电波方法光谱法分光光度法光谱法核磁共振可见光*物质对光的吸收具有选择性，若溶液选择性地吸收了某种颜色的光，则溶液呈吸收光的互补光。表1物质的颜色与吸收光颜色的互补关系*Lamber-Beer定律-分光光度法理论基础Lamber-Beer定律的物理表示式：A=KCL含义：当一束单色光通过溶液介质后，光能被吸收一部分，吸收多少与溶液的浓度和厚度成正比。*Lamber-Beer定律应用定性分析：与已知物质吸收光谱相比较，特征值→定性依据（1）比较广谱的一致性：吸收峰位置、数目、强度、形状。（2）比较λmax或ε的一致性。（3）比较吸光度比值：OD260nm/280nm定量分析：使用分光光度法测定溶液某物质的浓度（1）标准曲线法（2）标准管法（3）摩尔吸光系数法*标准曲线法取标准品配制成一系列已知浓度的标准溶液（5个以上），在最适波长处（通常为λmax），用同样厚度的吸收池分别测定其吸光度，作图，以A值为纵坐标，C值为横坐标，得一通过坐标原点的直线——标准曲线。然后将被测溶液置于吸收池中，在相同条件下，测量其吸光度，根据吸光度即可在标准曲线上查得其对应的含量。使用时要注意标准溶液和待测溶液在相同条件下进行测量，且溶液的浓度在标准曲线的线性范围内。*理想标准曲线：一条斜率接近1且通过原点的直线。标准溶液浓度应在被测物质浓度的一半到两倍之间，吸光度：0.05—1.0，至少五个点。*标准管法将已知浓度的标准品（其浓度用Cs表示），与待测样品在相同条件下显色、比色。测出吸光度，由于是相同物质相同条件。可按照下试求得样品浓度：*分光光度计主要部件:光源单色器样品室检测器讯号处理及显示器钨灯或卤钨灯——可见光源氢灯或氘灯——紫外光源光源：*分光光度法的特点：

（1）灵敏度高；（2）准确度高；（3）操作简便快速；（4）应用广泛。*双缩脲法测定蛋白质含量——标准曲线法*加热＋NH322H－1800双缩脲22222脲与硫酸铜的碱性溶液，生成紫色络合物。实验原理：*蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关，因此被广泛地应用。在一定的实验条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540nm下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。除－CONH－有此反应外，－CONH2－，－CH2－NH2，－CS－NH2等亦有此反应。*试管编号012345测定标准蛋白10g/L（ml）—0.10.20.30.40.5—生理盐水（ml）0.50.40.30.20.1—0.4未知蛋白质(ml)——————0.1双缩脲试剂（ml）3.03.03.03.03.03.03.0相当蛋白质（g/L）01020304050标准曲线法测定蛋白质含量*测定蛋白质含量方法的比较：凯式定氮法：最经典，应用范围广，灵敏度高0.2~1.0mg、准确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定。双缩脲法（Biuret法）：灵敏度较低，1~2mg。但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。Folin－酚试剂法（Lowry法）：较双缩脲法灵敏，50~100μg。但易受