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高速逆流色谱应用研究

摘要本文介绍了高速逆流色谱技术的工作原理、特点，综述了近年来高速逆流色谱(HSCCC)在分离制备天然产物、蛋白质、抗生素、无机物等领域的进展，尤其是近几年在中药尤其是植物药有效成分分离纯化方面的应用情况，总结了适用于HSCCC的溶剂体系，并展望了HSCCC与质谱、蒸发光散射联用等新技术的应用前景。

关键词高速逆流色谱，溶剂选择，天然产物，抗生素，蛋白质，无机物，质谱，蒸发光散射

1引言

高速逆流色谱(high-speedcountercurrentchromatography，简称HSCCC)是一种较新型的液—液分配色谱,由美国国立健康研究院（NationalInstituteofHealth,U.S.A.）Ito博土最先研制开发，其原理是基于样品在旋转螺旋管内的互不混溶的两相溶剂间分配不同而获得分离，因而无须任何固体载体或支撑体，能达到在短时间内实现高效分离和制备，并且可以达到几千个理论塔板数。与其他柱色谱相比较，它克服了固定相载体带来的样品吸附、损失、污染和峰形施尾等缺点[3]。目前此项技术已被应用于生化、生物工程、医药、天然产物化学、有机合成、环境分析、食品、地质、材料等领域[5]。我国是继美国、日本之后最早开展逆流色谱应用的国家，俄罗斯、法国、英国、瑞士等国也都开展了此项研究。美国FDA及世界卫生组织（WHO）都引用此项技术作为抗生素成分的分离检定，90年代以来，高速逆流色谱被广泛地应用于天然药物成分的分离制备和分析检定中。本文对高速逆流色谱的原理特点及应用作一综述。

2高速逆流色谱仪及溶剂体系简介

2.1高速逆流色谱仪原理及特点

HSCCC利用了一种特殊的流体动力学(单向流体动力学平衡)现象。具体表现为一根100多米长的螺旋空管，注入互不相溶的两相溶剂中的一相作为固定相，然后作行星运动；同时不断注入另一相（流动相），由于行星运动产生的离心力场使得固定相保留在螺旋管内，流动相则不断穿透固定相；这样两相溶剂在螺旋管中实现高效的接触、混合、分配和传递。由于样品中各组分在两相中的分配比不同，因而能使样品中各组分得到分离。

2.2HSCCC的优点

HSCCC主要具有以下几个方面的优点。

2.2.1应用范围广，适应性好。由于溶剂系统的组成与配比可以是无限多的，因而从理论上讲HSCCC适用于任何极性范围的样品的分离，

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2.2.5分离效率高，分离量较大。由于其与一般色谱的分离方式不同，能实现梯度操作和反相操作、亦能进行重复进样，使其特别适用于制备性分离，产品纯度高。研究结果表明:一台普通的高速逆流色谱仪一次进样可达几十毫升，一次可分离近10

最初的高速逆流色谱仪只有一个分离柱，用配重平衡离心体系。最近的仪器在设计上有较大突破，采用多个分离柱，不用配重，性能和实用能力大大提高。目前高速逆流色谱仪有分析型和半制备、制备型三大系列，较大的制备型HSCCC，柱容积可达1000mL，一次最多进样可达20g粗品。不但适用于非极性化合物的分离，也适用于极性化合物的分离，对检测器的灵敏度要求不高。在制备分离方面，可用于天然产物中各组分的分离，也可进一步精制，甚至直接从粗提物一步纯化到纯品。

2.3溶剂体系的选择

正确地选择溶剂体系是HSCCC分离成功的关键。通常所用的溶剂体系分为三类:亲水体系，由极性小的非水相与水相组成，两相极性相差很大；亲油体系，由高极性的非水相与水相组成，两相极性相差不大；还有一类处于两者之间，为中间体系。选择溶剂体系时遵循两个原则[6,9]：（1）溶剂体系的分层时间小于30S；（2）目标样品的分配系数K接近于1，容量因子大于1.5。选择的方法有三种：参考前人体系、薄层色谱、高效液相。正己烷／乙酸乙酯／正丁醇／甲醇/水和氯仿／甲醇／水是比较经典的两个体系。对于未知样品混合物，推荐先采用正己烷／乙酸乙酯／甲醇/水(1∶1∶1∶1)或氯仿／甲醇/水(10∶3∶7)尝试，再根据目标组分的分配系数调整溶剂组成[9]。如可用乙醇代替甲醇增加体系的疏水性；加入盐(乙酸铵等)或酸(三氟乙酸或乙酸)增加体系亲水性。有文献报道：正丁醇／乙酸乙酯/水(3∶2∶5)适于分离极性大的物质，而正庚醇／乙酸乙酯／甲醇/水(6∶1∶6∶1)适于分离弱极性和非极性物质[10]。

近年来，溶剂体系的选择范围越来越广泛。有人用超临界二氧化碳(SFCO2)作流动相[11]，利用SFCO2高扩散性、低粘度、流体特性、环境友好等优势[12]。还有人用制冷剂R134a(1，1，1，2—tetrafluoroethane)作流动相。由于B134a这种流动相在常温常压下是气体，不必再富集或蒸干溶剂收集，从而避免了纯