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流式细胞分析细胞凋亡常用的细胞凋亡检测方法1PI单染色法PI单染色法的最大优点在于获得凋亡细胞百分数的同时,可以与细胞周期中其他时相的细胞进行比较。方法简便、标本制备容易,检测费用低,是目前最经典也是最常用的细胞凋亡检测方法。第95页,共106页,星期六,2024年,5月流式细胞分析细胞凋亡常用的细胞凋亡检测方法1PI单染色法但是PI单染色法无法确认是来自哪一时相的凋亡。对于S期和G2/M期的细胞发生凋亡时,凋亡峰有时与G1峰或S峰重叠,导致G1峰或S峰增宽,或无典型的亚二倍体峰出现。第96页,共106页,星期六,2024年,5月流式细胞分析细胞凋亡常用的细胞凋亡检测方法2AnnexinⅤ/PI双染色法凋亡发生时,胞质膜的变化发生最早。在凋亡早期阶段,细胞内Ca2+持续、快速升高,致使大量Ca2+激活谷氨酰胺转移酶,谷氨酰胺转移酶的活化使胞质膜的不对称性丧失,导致膜内侧PS从细胞膜内层暴露于外层,从而可被PS特异的AnnexinⅤ探针所标记。第97页,共106页,星期六,2024年,5月流式细胞分析细胞凋亡常用的细胞凋亡检测方法2AnnexinⅤ/PI双染色法AnnexinⅤ为35-36KDCa2+依赖性磷脂结合蛋白,对PS有极强的亲和性,并可被FITC、PE等荧光物质标记。因此,采用AnnexinⅤ这一敏感的探针可检测暴露于细胞膜表面的PS。第98页,共106页,星期六,2024年,5月流式细胞分析细胞凋亡常用的细胞凋亡检测方法2AnnexinⅤ/PI双染色法但是,PS转移到胞膜外不是凋亡细胞所特有的,也可发生在细胞坏死中。二者的差别在于凋亡早期胞膜是完整的,而坏死在早期胞膜就被破坏了。第99页,共106页,星期六,2024年,5月流式细胞分析细胞凋亡常用的细胞凋亡检测方法2AnnexinⅤ/PI双染色法PI对胞膜完整的活细胞和早期凋亡细胞拒染,而对晚期凋亡和坏死细胞可以染色。因此,AnnexinⅤ结合PI进行双染色可用于检测活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。第100页,共106页,星期六,2024年,5月流式细胞分析细胞凋亡常用的细胞凋亡检测方法2AnnexinⅤ/PI双染色法制备单细胞悬液,调整细胞浓度为1×106/ml,加入AnnexinⅤ-FITC和PI,轻轻混匀,室温、避光孵育15min,1h内进行流式检测。第101页,共106页,星期六,2024年,5月流式细胞分析细胞凋亡常用的细胞凋亡检测方法2AnnexinⅤ/PI双染色法激发光波长为488nm,用525nm的带通滤片检测FITC,用610nm的带通滤片检测PI。分别通过FITC和PI对数荧光直方图或散点图分析活细胞、凋亡细胞和坏死细胞百分率。第102页,共106页,星期六,2024年,5月流式细胞分析细胞凋亡常用的细胞凋亡检测方法2AnnexinⅤ/PI双染色法对照设定:1单纯活细胞,不加AnnexinⅤ和PI;2活细胞只加AnnexinⅤ,不加PI;3活细胞只加PI,不加AnnexinⅤ;4已知凋亡的细胞系作为阳性对照;已知未凋亡的细胞系作为阴性对照。第103页,共106页,星期六,2024年,5月流式细胞分析细胞凋亡常用的细胞凋亡检测方法2AnnexinⅤ/PI双染色法第104页,共106页,星期六,2024年,5月流式细胞分析细胞凋亡常用的细胞凋亡检测方法2AnnexinⅤ/PI双染色法凋亡时胞膜改变远远早于DNA改变,因此,AnnexinⅤ/PI双染是检测早期凋亡的敏感方法。由于必须用活细胞,因此检测时间受到严格限制,而且对晚期凋亡细胞和坏死细胞无法准确区分。第105页,共106页,星期六,2024年,5月感谢大家观看第106页,共106页,星期六,2024年,5月流式细胞分析细胞凋亡细胞对染料吸收能力的检测赫斯特类染料(特别是HO33342)检测细胞凋亡的原理与上述染料不同。HO33342是双苯并咪唑家族成员之一,能特异与DNA螺旋中富含A-T重复序列结合。HO33342用氪激光激发紫外线荧光,激发光波长为352nm,发射光波长为400-500nm,产生蓝色荧光。第63页,共106页,星期六,2024年,5月流式细胞分析细胞凋亡细胞对染料吸收能力的检测HO33342能被活细胞摄取,而其从细胞内排出是一个耗能的主动过程,依赖细胞膜上的P-糖蛋白泵。活细胞染色时,应考虑是否存在细胞抗药性问题,如有耐药性,则染色效果不佳。HO33342进入凋亡细胞比正常细胞多,将其与PI结合对凋亡细胞进行双染,可将正常细胞、凋亡
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