分子医学实验 CC层析技术学习课件.doc

专业：医药1211姓名：崔露允

专业：医药1211

姓名：崔露允

学号：3120102857

日期：2013年12月31日

地点：医学教学楼A-511

课程名称：分子医学实验指导老师：应李强成绩：

实验名称：层析技术实验类型：生物化学同组学生姓名：蒋灵旭

一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填）

三、主要仪器设备（必填） 四、操作方法和实验步骤

五、实验数据记录和处理 六、实验结果与分析（必填）

七、讨论、心得

一、实验原理

层析法又称色谱法，是广泛应用的一种生物化学技术。层析法是利用混合物各组分物理化学性质（如溶解度、吸附能力、电荷和分子量等）的差别，使各组分在支持物上集中分布在不同区域；借此将各组分分离的方法。层析利用两个相，一个相称为固定相；另一个相称为流动相。由于各组分受固定相的阻力和受流动相的推力影响不同，各组分移动速度各异，从而使各组得到分离。

（一）薄层层析分离脂类

薄层层析是将固定相支持物均匀地铺在玻璃板上成为薄层，然后将要分析的样品点加到薄层上，用合适的溶剂展开而达到分离的目的。薄层层析的优点是设备简单易行、展开时间短、分离迅速、样品用量小、灵敏度高、分离时几乎不受温度的影响，甚至不受腐蚀性显色剂影响，可以在高温下显色，分离效率高。薄层层析是一项常用的分离、鉴定脂类的技术。

（二）离子交换层析分离混合氨基酸

离子交换层析是利用离子交换剂上的可交换离子与周围介质中被分离的各种离子间的亲和力的不同，经过交换平衡达到分离目的的一种柱层析法。氨基酸是两性电解质，每一种氨基酸都有它特定的等电点，各种氨基酸在pH小于其等电点的溶液中以阳离子的形式存在，可以与阳离子交换剂进行交换，再慢慢增大洗脱液的pH，氨基酸将依照其等电点由小到大的顺序逐渐洗脱，此时分部收集各洗脱组分，即可将各种氨基酸一一分离。

（三）纸层析法－转氨基作用验证

转氨基作用是氨基酸代谢中的一个重要反应。在转氨酶的作用下，将氨基酸的氨基转移到α-酮酸上。每种转氨基反应均由专一的转氨酶催化,转氨酶广泛分布于机体各器官、组织。

本实验用纸层析法来观察α-酮戊二酸与丙氨酸在丙氨酸氨基转移酶(ALT)催化下的转氨基作用.它们催化的反应如下：

以酚、水混合液为层析展开剂，利用滤纸表面的羟基等亲水基团与水之间的亲和力，使展开剂中水的展开速度明显小于酚，即以水为固定相，酚为流动相,利用谷氨酸和丙氨酸亲水性的不同,以达到分离鉴定的目的。本实验利用氨基酸与茚三酮的呈色反应观察实验结果。

由于失活的酶没有转氨基作用，因此不能产生α-丙氨酸，用纸层析分离混合物即可证明。

二、实验步骤

（一）薄层层析

研钵中放入硅胶G2g?加入0.3%羧甲基纤维素8mL?研匀?迅速倒在8cm×12cm玻片上?水平放置?静置20min凝固?置100℃烘箱中烘干活化?毛细玻管吸取脂质标准液及试样，在薄板的一端1.5cm高度处间距约为1cm点样?待溶剂蒸发后置于层析缸中，浸入展开剂中?半小时后，展开剂上升至接近薄板上端时将薄板取出吹干?喷磷钼酸显色吹风机吹干?

比较脂质和试样所显斑点位置，作图记录

（二）离子交换层析分离混合氨基酸

pH=2.2的柠檬酸缓冲液润洗已装柱的层析柱?将混合氨基酸溶液0.2ml沿层析柱内壁加入，打开“再”形夹，控制流出速度为10~15滴/min?样品进入柱床后，用0.1M，pH2.2柠檬酸缓冲液加入洗柱?用0.1M，pH5.0柠檬酸缓冲液洗脱，保持流速10~15滴/min，每管收集1ml，收集15管?所有收集管分次用茚三酮反应检测氨基酸，茚三酮反应检测连续两管呈阴性，改用0.1MNaOH以同样流速及收集体积洗脱，并对各管收集液进行氨基酸检测

（三）纸层析法－转氨基作用验证

取小白鼠1只，颈椎脱臼法处死，剪下全部肝脏，经0.9%NaCl溶液洗去血污?把肝脏置研钵中，加入玻璃砂少许，加0.01mol/L，pH=7.4磷酸缓冲溶液5mL磨成匀浆?取离心管2只，各加肝匀浆10滴，将1号管置沸水浴中5分钟?两管各加1%谷氨酸钾溶液10d，1%丙酮酸钠溶液10d，0.25%一碘醋酸钾溶液5d，40℃水浴中保温30min?取出，向两管各加5%Hac溶液2d，置沸水浴中5min，冷却后离心(2000r/min，5min)?将上清液移入另外同样编号的1.5ml小塑料离心管中备用?在10cm×20cm滤纸上，距短边2.5cm处做一折痕?用毛细管分别吸