物理方法诱导细胞融合的进展.ppt

**物理方法诱导细胞融合的进展一.细胞融合简介二.传统物理融合方法三.其他物理融和方法细胞融合技术是近年来迅速发展起来的一项新兴细胞工程技术，在外力（诱导剂或促融剂）作用下，2个或2个以上的异源（种、属间）细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合，并形成杂种细胞的现象称为细胞融合（cellfusion）或细胞杂交。(cellhybridization)它是利用现代科学技术，把来自于不同种生物的单个细胞融合成1个细胞，这个新细胞（杂合细胞）得到了来自2个细胞的遗传物质（包括细胞核的染色体组合和核外基因），将具有新的遗传学或生物学特性。细胞融合技术作为细胞工程的核心基础技术之一,已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大。细胞融合技术不仅为核质关系、基因调控、遗传互补、细胞免疫学、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理论领域的研究提供了有力的手段,而且被广泛应用于免疫学、遗传学、发生生物学,特别是在单克隆抗体及动植物远缘杂交育种等方面具有十分重要的意义。随着细胞融合技术研究的不断深入,细胞融合技术的发展前景及其产生的影响将日益显著。细胞融合方法有生物法、化学法和物理法，其中生物方法因病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大、实验的重复性差、融合率很低等。目前，这种方法主要适用于动物细胞融合，用于实验室。化学法因为存在对细胞损伤大、残存毒性、融合率较低及经验性大等缺陷，目前应用也不广。而物理方法因融合频率高，是PEG的100倍；操作简便、快速；对细胞无毒；可在镜下观察融合过程等优点，显示出强大的生命力。二.传统物理方法1.电融合法2.激光融合法1.电融合法电融合诱导法是指利用电场来诱导细胞彼此连接成串，在施加瞬间强脉冲促使质膜发生可逆性电击穿，促使细胞融合的方法。自从1978年Zimmermann首先采用电脉冲方法成功地诱导了细胞电穿孔、电融合以来近三十年里,电穿孔和电融合技术不断发展完善成为一门比较成熟的学科,得到非常广泛地应用。1983～1988年期间,以Zimmermann为主的工作小组通过动物、植物和微生物细胞电融合实验得出高频短脉冲是可行的。并且认为高频短脉冲电信号可以用于细胞操控、基因工程和细胞融合,证明了利用电场这一物理因素诱导细胞融合具有普遍的适用性。由于电融合的可控性,使人们第一次在显微镜下直接观察细胞的融合过程,且电极间细胞的融合率高达10～80%。1991年Naton等提出利用融合对象间密度的差异来实现融合时的有序队列。在两电极间放入合适密度的媒质,混合的两种类型的原生质体就会形成两个不同的单层结构;在此情况下,可以获得很高的异核融合产率。融合率取决于所加电场的方向,如果接触区域是建立在阳极面,那么融合率就会比建立在阴极面提高两倍。他们采用的实验样本是美洲狼尾草叶肉细胞和烟草叶肉细胞的原生质体。1993年俄罗斯研究人员Abidor等采用了一种新的方式来研究细胞融合和高电场中细胞膜的电学特性。他们将L929细胞和其它的四种类型细胞的悬浮液放入特殊的腔室中,通过离心力作用将细胞紧压同时所测量紧压体系的电阻值间接地发映出离心过程中状态的变化情况,并通过对比试验揭示出膜接触程度的近与远是影响细胞融合率高与低的关键因素。2000年Mekid等首次报道了电场作用下组织中发生细胞电融合过程,他们采用B16鼠科黑素瘤组织,在不施加和施加500V/cm,1350V/cm,2000V/cm等不同场强条件下,得到了电融合后的细胞并通过相互对比得出高场强作用下融合过程比较明显的实验结果。虽然此时细胞融合率已经比较高,但是电极间距离仍然属于毫米级,所以在进行细胞电融合时,电压必须提高到300V以上才能够达到细胞电融合所需的电场强度。此外,融合装置体积比较大但是细胞融合通量较低,这些不利因素都限制了细胞电融合的推广。2004年日本东京大学的研究人员采用硅电极、玻璃与PDMS相结合的微流控芯片制作出了高纵横比的电极,并且采用低电压技术实现了高效的细胞融合,融合率达到75%。2007年Jongil等在“芯片实验室”水平上通过电融合手段,实现了对日本美口菌和珊瑚菜的电融合过程。他们的芯片是由玻璃作为基底,PDMS通过铸模方式实现微流控通道的制作然后利用等离子键合使上下两层紧密结合,很大程度上提高了细胞1:1的对准并发生融合的概率。在交流电压1～2MHz峰峰值8～10V的矩形脉冲作用下实现排队过程;然后采用周期为10～100毫秒幅值为250mV的