MLPA 实验方法讲解_Optimized.pptx

1目的

拷贝数变异(CNV)是人类DNA遗传变异的重要来源，多重连接依赖性探针扩增(MLPA)技术是广泛应用的分子生物学技术，可对人类遗传疾病研究中的多种DNA序列进行拷贝数检，是一种半定量技术。MRc-Holland开发了大量商业化的人类遗传疾病和癌症研究的MLPA检测产品。有关产品本身的详细信息、MLPA实验方案、以及推荐的MLPA数据分析软件，参见网址。

2MLPA分析原理

该技术基于探针寡核苷酸的连接和PCR扩增，涵盖了多达60对可对目标基因座进行杂交的多重探针寡核苷酸(每个探针检测长度约为60nt)。每对寡核苷酸适用于特定长度(64-500nt)的扩增产物；并且通过序列标记末端，所有连接的探针可以在PCR反应中用单个引物对扩增。正向PCR引物携带荧光标记，可在自动毛细管电泳(ce)系统上按照探针的分子大小进行检测和定量。该方法已成功应用于外显子缺失和重复引起的疾病研究中,如杜氏肌营养不良症(DMD)和BRCA1/BRCA2基因分析。此外，MLPA技术的升级也可用于各种基因组序列的定量甲基化分析。

MLPA是一种相对的技术:只有通过比较DNA样品的MLPA峰型才能检测出相对的差异。因此，在同一运行中必须包含参考样本。每个探针峰的相对高度，与各种参考DNA样品的相对探针峰高度相比，反映了样品中相应目标序列的相对拷贝数。因此，一个或多个靶序列峰高的相对降低反应了缺失，而相对峰高的增加反映了重复。

3关键词

MLPA(MultiplexLigation-dependentProbeAmplification)：多重连接依赖性探针扩增。

4实验

4.1试剂

4.1.1试剂盒项

Itemno.

Description

Numberofreactions

FluorescentlabelPCRprimer

EK1-FAM

SALSAMLPAEK1reagentkit

100

FAM

EK5-FAM

SALSAMLPAEK5reagentkit

500

FAM

EK20-FAM

SALSAMLPAEK20reagentkit

2000

FAM

EK1-Cy5

SALSAMLPAEK1reagentkit

100

Cy5

EK5-Cy5

SALSAMLPAEK5reagentkit

500

Cy5

Reagentkitcomponent

Volumes

Ingredients2

EK1

EK5EK20

MLPA®GeneralProtocolInstructionsForUse

4.1.2试剂盒组件

5.1.1变性

a标记0.2毫升的PCR管或8连管或96孔板；

b向每个管或孔中加入5μlDNA样品(50-250ng;最佳50-100ng)。使用TE进行无DNA质控；

c将PCR管或8连管或96孔板放入热循环仪中，启动MLPA热循环仪程序，将样品DNA在98°C下

变性5分钟，然后冷却至25°C保存。

5.1.2杂交

a准备杂交主混合物。对于每个反应mix：1.5μlMLPA缓冲液(黄色帽)+1.5μl探针混合物(黑色帽)，

通过吹打或涡旋将杂交主混合物充分混合。

b向每个变性产物中加入3μl杂交主混合物。通过上下吹打充分混合。

c运行热循环仪程序：95°C下孵育1分钟，然后在60°C下孵育16-20小时。孵育结束后将样本在热

循环仪上45°C保持。

SALSAMLPABuffer

(yellowcap)

180µl

5×180µl

5×700µl

KCl,Tris-HCl,EDTA,PEG-6000,

oligonucleotides

SALSALigase-65

(greencap)

115µl

5×115µl

5×460µl

Glycerol,EDTA,Beta-Mercaptoethanol,KCl,Tris-HCl,non-ionicdetergent,Ligase-65enzyme(bacterialorigin)

LigaseBufferA