ThermoFishe cfTNA Panel 验证方案学习.docx

OncomineLungCell-FreeTotalNucleicAcid

1

1.1

1.2

1.3

2

2.1

ResearchAssay验证分析

描述

OncomineLungcfTNA检测从全血血浆组分中分离的肺癌肿瘤来源无细胞DNA和RNA(无细胞总核酸；cfTNA)。其提供了文库构建试剂，以及用于从单管10mL全血的血浆组分中获得的cfTNA制备扩增子文库的多重PCR引物池。

优势

?侵入性较小，可在多个时间点采集样品以监测癌症进展

?成本较低

?从样品到结果的周转时间更短

?更好地表示肿瘤异质性

检测类型

?热点基因(SNV)和短插入缺失：ALK、BRAF、EGFR、ERBB2、KRAS、MAP2K1、MET、NRAS、PIK3CA、

ROS1和TP53(覆盖~168个热点)

?基因融合：ALK、RET、ROS1

?MET14外显子跳跃

?拷贝数基因(CNV)：MET

检测下限

20ngcfDNA起始量下：

?对于SNV/短插入缺失，可实现LOD为0.1%、灵敏度为~90%、特异性99%

?对于融合和MET外显子跳读，可实现LOD为1%、灵敏度为90%、特异性99%

?对于METCNV靶标，可实现检测低至1.2倍扩增、灵敏度为90%、特异性99%

分析方法

整个工作流程，从使用MagMAX无细胞总核酸分离试剂盒分离cfTNA到样品分析，可使用IonS5XL测序系统在两天内完成。

实验流程

PurifythetargetampliconsSizeselectthebarcodedlibrary

Purifythetarget

amplicons

Sizeselectthebarcodedlibrary

Oncomine

Oncomine?

LungCell?FreeTotalNucleicAcidResearchAssay

cell

cell?freetotal

nucleicacid

Reversetranscribe

cell-freetotal

nucleicacid

Amplifytargets

4

45μL(1.5×samplevolume)ofAgencourt?AMPure?XPReagent150μLof80%ethanol

24μLofLowTE

Amplifythetarget

ampliconswith

barcodedprimers

Purifythebarcoded

library

57.5μL(1.15×samplevolume)ofAgencourt?AMPure?XPReagent

150μLof80%ethanol

50μLofLowTE

50μL(1.0×samplevolume)ofAgencourt?AMPure?XPReagent150μLof80%ethanol

30μLofLowTE

Quantifythe

librarybyqPCR

3开发验证

3.1样本储存条件验证

3.1.1血液收集管验证

3.1.1.1验证方案

3.1.1.2验证结果

不同储存条件下的测序结果比较

3.1.1.3验证结论

在0.1％的LOD下，Streck管的假阳性率高于EDTA管。因此，建议使用K2EDTA血液采集管进行OncomineLungcfTNA研究分析。使用K2EDTA试管时样品应在采集后6小时内处理，以避免白细胞裂解。如果无法在采集后的6小时内进行血液处理，则白细胞稳定管(例如Streck管)可在处理时间上提供更大的灵

活性。

3.1.2血液在Streck管的储存时间验证

3.1.2.1验证方案

3.1.2.2验证结果

采集后不同时间处理后的测序结果比较

RNA质控基因分子计数

3.1.2.3验证结论

室温下保存一天后，热点位置存在更多的假阳性，提示更多的DNA损伤。为了最大程度地减少误报，