MiSeq System文库变性和稀释指南.docx

MiSeqSystem文库变性和稀释指南

摘要

本指南介绍了对Illumina?MiSeq?system上进行测序的文库进行变性和稀释方法，同时介绍了用作测序控制PhiX文库的制备说明。

耗材和设备

耗材

名称

供应商

HT1(HybridizationBuffer),thawedandprechilled

Illumina提供的MiSeqReagentKit

IlluminaPhiXControl,Catalog#FC-110-3001

Illumina(选择)

1.0NNaOH,molecularbiology-grade

一般实验室供应商

Tris-Cl10mM,pH8.5with0.1%Tween20

一般实验室供应商

设备

名称

供应商

hybex微型孵化器(HybexMicrosampleIncubator)

1.5ml的离心管

SciGene,catalog#1057-30-O(115V),orequivalentSciGene,catalog#1057-30-2(230V),orequivalent

SciGene,catalog#1057-34-0,orequivalent

碱基组成多样性差的文库(lowdiversitylibraries)

Lowdiversitylibraries是大量读数具有相同序列的文库。一些研究表明一种类型转录物、低复杂性扩增子库、接头二聚体或亚硫酸氢盐测序中存在大于25%低序列多样性。PhiX的高浓度加入有助于平衡序列多样性的整体缺失。

对于碱基组成多样性差的文库，将您的PhiX质控文库稀释至与变性文库相同的浓度。

1试剂准备

1.1准备新鲜稀释的NaOH

取800μLaboratory-gradewater至1.5ml微量离心管中

添加200μL的1.0NNaOH，获得1ml含0.2NNaOH溶液

颠倒1.5ml的离心管数次混匀

注：

始终准备新鲜稀释的NaOH用于变性文库以便簇生成。

为防止小的移液误差影响最终的NaOH浓度，准备至少1ml新鲜稀释的NaOH。

为获得最佳结果，请在变性和稀释文库之前解冻测序试剂。参考MiSeqSystemUserGuide(part

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1.2准备HT1

将-25°C─-15°C储存的HT1移至室温溶解

待HT1溶解后储存至2°C─8°C冰箱中备用

1.3稀释变性PhiX质控

名称

最终PhiX浓度

MiSeqReagentKitv3

将变性PhiX对照稀释至20pM，对于v3试剂能够产生最佳簇密度

MiSeqReagentKitv2

将变性PhiX对照稀释至12.5pM，对于v2试剂能够产生最佳簇密度

1.3.1稀释PhiX文库至4nM

取2μl10nMPhiX文库至1.5ml的微量离心管中

添加3μl10mMTris-Cl,pH8.5with0.1%Tween20

1.3.2变性4nMPhiX文库

向上述准备好的4nMPhiX文库中加入5μl已准备好的0.2NNaOH

短暂漩涡混匀后280×g离心1min

室温孵育5min

添加990μl准备好的HT1，获得1ml含20pM变性的PhiX文库

您可以将变性的20pMPhiX文库在-15℃至-25℃下保存3周。3周后，簇数趋于减少

1.3.3稀释PhiX文库至12.5pM(如果您正在使用MiSeq试剂盒v3，则不需要进一步稀释)取上述已变性的20pMPhiX文库375ul至1.5ml的离心管中

添加225μl预冷的HT1，至终体积600μl的12.5pMPhiX文库

1.4稀释变性文库

1.4.2方案A：标准归一化法

使用方案A对文库进行变性和稀释，推荐使用文库制备文件中的标准文库量化和质量控制程序进行归一化

名称

兼容的变性和稀释步骤

MiSeqReagentKitv3

MiSeqReagentKitv2

4nMlibrary—Resultsina6–20pMloadingconcentration.

4nMlibrary—Resultsina6–20pMloadingconce