如何养好细胞——细胞污染的防治.pptxVIP

如何养好细胞——污染的防治

状态好的细胞是做好一切实验的基石好的细胞状态是好的结果重复性的保证

污染——细胞培养的大敌影响细胞状态影响细胞的生长与细胞竞争营养最终导致细胞死亡对于新手，细胞污染几乎是无法防止的问题！

什么是细胞污染？凡混入细胞培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应视为污染细胞污染不能完全被消除，但能减少其发生的频率和后果的严重性

细胞污染的分类物理污染化学污染生物污染

物理污染

危害引起细胞代谢发生改变，如细胞同步化、细胞生长受抑制甚至细胞死亡

化学污染

危害化学物质并不总是抑制细胞的生长，某些化学物质如激素就可促进细胞的生长。不同细胞对化学物质污染的反响是不一样的。金属离子、有机分子、细胞内毒素等物质对水的污染。超纯水放置过久其纯度会下降血清又是潜在的生物及化学污染的来源/血清采集于多个动物，而且不同厂商的生产工艺及质量各不相同，因此血清中许多成分的浓度存在很大的变异培养液、培养附加成分、试剂培养液、培养附加成分、试剂都可能成为化学性污染的来源。采取标准的操作步骤，防止液体体积计算错误，培养器皿的大小，构形设计可能会影响到培养中气体交换、湿度、培养液的pH值和细胞生长密度。培养器皿的工艺及灭菌过程中的差异可能对培养体系产生影响。

生物污染来源1环境：细胞房以及内部设施；培养箱；超净工作台；保存细胞的液氮2操作者本身3操作器械4血清5培养液及的试剂6运输

生物污染的种类：1细菌〔金黄色葡萄球菌、大肠杆菌〕，真菌〔霉菌、白色念珠菌、酵母〕，黑焦虫2支原体、病毒3其他细胞交叉污染

细菌污染

——293细胞50X100X

细菌污染

——293细胞200X

细菌污染

——293细胞，正常

霉菌污染

——sk-hep-1细胞50X100X

霉菌污染

——sk-hep-1细胞，正常50X100X

支原体污染

——MHCC-LM6细胞50X100X

支原体污染

——MHCC-LM6细胞，正常50X100X

支原体污染

——T-47D细胞200X400X

支原体污染

——T-47D细胞，正常100X

其他污染

——MEF细胞100X，污染100X，正常

细胞交叉污染Celllinecross-contamination：20世纪60年代被发现细胞污染和细菌污染不同，细胞污染是由于在培养过程中各种细胞同时进行，而所用器具或液体混杂使用所致。这种污染没有微生物存在，但使培养细胞不同种类之间发生混乱，细胞生长特性，形态发生变化。有些变化轻微，不易觉察，有些那么可能由于污染的细胞具有生长优势而最终压过原来细胞而导致细胞生长的抑制，最终死亡。污染过的细胞由于种类不纯，无法进行实验研究。据估计，15%-20%的时间里，实验中所使用的细胞已经不是原来的细胞系，或者与其他细胞系发生了交叉污染。鉴定方法：短串联重复序列〔STR〕分析的DNA指纹图谱

CrossContaminationsv6_8-March9,2012

如何判断污染 ？第一类污染，较易判断，肉眼即可观察。污染物与细胞在同一平面；细菌污染：培液易浑浊，低倍镜下即可见大量类似浮游生物的小黑点在做自主运动，高倍镜下观察，可见细菌形态：大肠杆菌为杆状，像双截棍；金黄色葡萄球菌为球状；真菌污染：短期内培养液多不变混浊培，但是有漂浮物，或者在皿底看到众多克隆状物体，倒置显微镜下可以看见细胞之间有纵横交错穿行的丝状，树枝状或管状菌丝，并漂浮在培养液中念珠菌及酵母菌菌株呈卵圆形，散在细胞上及细胞周边生长；有时通过显微镜可能会发现在培养瓶外壁生长的菌丝，较易误认为污染。发现瓶外的菌丝后应及时用酒精擦拭干净。

如何判断污染 ？第二类污染：需要借助试剂盒，经验丰富者也可判断支原体：PCR法〔假阴性〕HoechstDNA染色〔假阳性〕病毒：较隐蔽，荧光显微镜第三类污染：最难发现，当发现细胞生长特性和形态突然发生变化，而细胞又没有其它污染时，要考虑该污染；关键：在于经验，平时养细胞时多留意细胞状态，在细胞状态好、代数低的时候一定要拍照存档，以此作为参考衡量细胞状态。对于新接手的细胞一定要清楚它正常的形态的时候的样子。这样，能在第一时间发现细胞异常并及时处理。

与培养体系中的异物区分开：棉絮，塑料渣，外来颗粒，血清中变性的蛋白质等，细胞碎片有些异物会作布朗运动，需要与细菌等的自主运动区分开主要特点：易增殖，与细胞夺取营养。轻者细胞生长缓慢，分裂相减少，细胞变得粗糙，轮廓增强，胞浆中出现较多的颗粒物质；较重的细胞增殖停止，分裂相消失，细胞质中出现大量堆积物，细胞变圆或崩解，从瓶壁脱落。

传说中的黑胶虫？这是什么污染？在高倍镜下〔400X〕观察有很多会动的小微生物，但是培养基不变浑浊，也不影响细胞生长，低倍镜下