高效液相色谱法同时测定右旋糖酐发酵液中的多种糖分.pdfVIP

高效液相色谱法同时测定右旋糖酐发酵

液中的多种糖分

右旋糖酐为一种由若干葡萄糖分子脱水形成的无毒无害的高分

子聚合物，具有免疫刺激、抗炎症、抗微生物、抗感染、抗肿瘤、抗

辐射、降低胆固醇以及治愈创伤等生物学活性。中低分子量的葡聚糖

作为血浆补充剂在医学、兽药生产被广泛应用。近年来，将中低分子

量葡聚糖的衍生物制备药物载体输送系统成为国内外学者研究的热

点，具有广阔的应用前景。

右旋糖酐的合成体系组分复杂，随着右旋糖酐的生成，发酵液黏

度增加，一般常用测定体系黏度的方法对转化过程进行监测。但转化

体系的黏度不仅与右旋糖酐的生成量和分子量有关，还会受到发酵液

中其他组分变化的影响，难以准确监测转化过程的进行。

单一糖分或多种糖分含量的测定常用化学法、比色法、旋光法、

气相色谱法等方法。化学分析方法只能测定体系中各种糖分的总量，

而不能分别测定各种糖分的含量。气相色谱法虽可分别测定不同糖的

含量，灵敏度高，但由于糖难以汽化，必须进行衍生化反应才可检测，

使检测步骤繁琐。能够快速、准确同时测定多种低分子量糖的检测方

法并不多，其中高效液相色谱法是一种测定低分子量糖较好的方法。

1

本文针对右旋糖酐转化体系的特征，采用流动相乙腈水溶液预处理发

酵液，使其中右旋糖酐沉淀，消除对发酵液中糖分测定的影响，选用

OSMOSILSugar-D(4.6mmI.D.times;250mmtimes;0.46mu;m)色谱柱，通

过色谱条件选择，同时测定右旋糖酐发酵液中蔗糖、果糖和葡萄糖等

糖分的含量，测定方法操作简单，快速准确，为监控生物转化合成右

旋糖酐过程提供了一种技术途径。

1材料与方法

1.1材料与试剂

蔗糖、果糖、葡萄糖(标准品)、乙腈(色谱纯)：国药集团化学试剂

有限公司;菌种(CICC20724)：中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.2仪器与设备

LC-20AD高效液相色谱仪(配RID-10A示差折光检测器)：日本岛

津公司;COSMOSILSugar-D色谱柱：日本NACALAITESQUE公司;高压蒸

汽灭菌锅：上海申安医疗器械公司;恒温摇床培养箱：瑞士AdolfKuhner

公司;冷冻离心机：湖南湘仪公司。

1.3方法

1.3.1色谱条件色谱柱：COSMOSILSugar-D(4.6mmI.D.times;250

mmtimes;0.46mu;m);进样量20mu;L，柱温：35.0℃，检测器温度：

40.0℃。

2

1.3.2色谱条件选择分别称取2.5g(精确至0.0001g)经干燥至恒

重的蔗糖、果糖、葡萄糖，用二重蒸馏水糖标准储备液3mL、葡萄糖

标准储备液4mL混匀，作为混合标准液，用0.45mu;m的水系针式过

滤头过滤，取滤液进样检测。改变流动相组成、流速，考察对3种混

合糖的分离效果。

1.3.3标准曲线绘制取25g/L蔗糖标准储备液以二重蒸馏水逐

级稀释，配制成浓度梯度为0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0g/L

的蔗糖标准溶液。标准溶液分别以0.45mu;m滤膜过滤，取滤液进样

检测，记录色谱图和峰面积。以峰面积为横坐标、质量浓度为纵坐标

制作蔗糖标准曲线。

2结果与分析

2.1色谱条件的选择

2.1.1流动相的选择按1.3.1节色谱条件，在流速为1.0mL/min

时，分别采用二次蒸馏水、40%、60%、70%和80%乙腈水溶液为流动

相，分析混合标准液，考察不同的流动相组成对3种糖分的分离效果。

2.1.2流速的选择按1.3.1节色谱条件，流动相为80%乙腈水溶

液，分别采用0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL/min，5个流速，分析混合

标准液，考察流速对3种混合糖的分离效果。

2.2标准曲线的绘制

3

在选定的色谱条件下，测定出不同质量浓度的蔗糖、果糖、葡萄

糖标样相对应的出峰面积可绘制出蔗糖、果糖、葡萄糖的标准曲线。

以出峰面积为横坐标，标样的质量浓度为