分子生物学常用技术课件.ppt

1分子生物学常用技术3PCR限制TaqDNA聚合酶活性的常用方法是:a):在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性.

b):在反应体系达到90度时，PAUSE，将温度保持在70度以上，手工加入polymerase，但这个方法过于烦琐，尤其是对高通量应用，并容易造成污染。c):其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，入镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。有很多公司提供这样的酶。d):hotstartpolymerase94度10-15min1分子生物学常用技术3PCR6:BoosterPCR(美俚热心的拥护者,后推的人,支持者,后援者,调压器)

开始几个cycles保持primer的低浓度1ughumangenomicDNA大约在3X100,000个模板分子,这样的模板分子数目可以是引物与模板很好的结合.当模板的浓度过低,比如低于100个分子时,引物和模板之间就很难发生反应.引物容易自身进行反应形成二聚体.这样就有来具体是这样的.开始几个cycles保持primer的低浓度,保证primer:template的molarratio在10,000,000~100,000,000:1.以确保开始扩增的准确性.然后boostePrimer的浓度到正常的水平1分子生物学常用技术3PCR7:循环数和长度

确定循环数的基本原理是:产物能够保证你进一步分析操作的最小循环数.产物的量不够,优化的方法有:

1):增加TEMPLATE

2):增加循环数

如何确定循环数：做一个PCR体系,40循环,50ul,分别在20,25,30,35循环时从体系中取5ul,一起跑电泳分析.从而确定最佳的循环数

另一个会影响PCR特异性的是PCRcycling时在两个温度间变化的速率(rampingrate).当然是越高越好.1分子生物学常用技术3PCR8:thermalcycler

PCR仪的因素我们经常容易忽视.长时间的使用后需要调整PCR仪,以保证其能够到达正确的温度.现在的PCR仪基本上都有自检功能(self-diagnosis).9:PCR增强剂

enhancer实在是多种多样.基本的原理不外是增加引物退火特异性,减少错配,增加产物的长度和产量:dimethylsulfoxide(DMSO)upto10%,formamideat5%,trimethylammoniumchloride10-100uM,detergentssuchasTween200.1-2.5%,polyethyleneglycol(PEG)60005-15%，glycerol10-15%,singlestrandedDNAbindingproteins，Gene32protein1nM,E.colisingle-strandedDNAbindingprotein5uM，7deaza-dGTP(forGCrich)150uMwith50uMdGTP,TaqExtender(stratagene)，PerfectMatchPCREnhancer(stratagene),Q-solution(Qiagen)

1分子生物学常用技术3PCR10:TemplateDNApreparation

提取DNA时的试剂会抑制PCR反应的顺利进行.因此需要对TEMPLATEDNA进行纯化.特别是SDS(0.01%)的情况下就能强烈抑制PCR的进行.可以加入一些nonionic试剂,如Tween,Nonid,Trition之类的反过来抑制SDS.还有proteinaseK也要除干净,不然会降解polymerase.11:NestedPCR

简单点说设计两对引物,一对是长的,一对是包含在长引物内的,用长引物扩增的产物作为第二次扩增的模板,这样可以增加产物的量.而且可以减少非特异性带和错配的情况.1分子生物学常用技术3PCRLaboratoryTechniqueUseCleanBench(Hood)UseNucleasefreetubesUseAerosolResista