流式细胞技术与流式细胞仪课件.ppt

11流式细胞技术（三）光学系统主要元件为滤光片，分长通滤光片、短通滤光片、带通滤光片。长波通双色性反射镜：大于特定波长的光通过而将小于特定波长的光反射11流式细胞技术光学系统示意图11流式细胞技术细胞通过激光照射区时，受激光激发，产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间360度立体角发射，产生散色光和荧光信号。（四）信号检测系统11流式细胞技术（四）信号检测系统散射光检测前向光散射（FSC,ForwardScatter）侧向光散射（SSC,SideScatter）散射光不依赖任何细胞样品的制备技术(如染色)，因此被称为细胞的物理参数或称固有参数。以上两种信号都是来自激光的原光束，其波长与激光的波长相同。荧光检测(Fluoresencedetector)11流式细胞技术（1）前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的信号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。11流式细胞技术FALSSensorLaser前向散射光示意图11流式细胞技术（2）侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90°角散射的信号，侧向散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。11流式细胞技术FALSSensor90LSSensorLaser侧向散射光示意图11流式细胞技术 测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。淋巴细胞单核细胞中性粒细胞光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群11流式细胞技术（3）荧光检测荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。线性放大器和对数放大器11流式细胞技术FITCTexasredPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光细胞悬液异硫氰酸荧光素得州红能量传递复合染料藻胆蛋白类几种常见的荧光染料11流式细胞技术11流式细胞技术（1）荧光信号的面积和宽度所谓荧光信号的面积是采用对荧光光通量进行积分测量，一般对DNA含量测量时，均采用面积(FL2－A)来计算。这是因为荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映DNA的含量。荧光信号的宽度(如FL2－W)常用来区分双联体细胞11流式细胞技术11流式细胞技术（2）荧光补偿原理11流式细胞技术双激光立体光路技术11流式细胞技术参数：FS,SS,FL数据显示方式（单参数直方图、双参数散点图、二维等高图、假三维等高图、三参数散点图）设门分析技术（五）数据的显示与分析11流式细胞技术FS：反映颗粒的大小SS：反映颗粒的内部结构复杂程度FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少一、参数11流式细胞技术单参数直方图双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图三参数直方图多参数分析直分析方图设门分析:REGION和GATE设置二、数据显示方式11流式细胞技术Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。设门分析技术11流式细胞技术由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。（一）单参数直方图11流式细胞技术单参数直方图细胞相对数量信道(channel)11流式细胞技术双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。（二）双参数直方图11流式细胞技术1.双参数直方图点图绿色荧光强度红色荧光强度11流式细胞技术双参数直方图点图11流式细胞技术*鞘液是不含细胞的磷酸缓冲液，鞘液与待测样品流成一定角度，这样，鞘流就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束