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试验一考馬斯亮藍G-250染色法测定蛋白质的含量（p24）
一、目的规定?
掌握考馬斯亮藍（CoomassieBrilliantBlue）法测定蛋白质含量原理和措施。
二、试验原理
考馬斯亮藍法测定蛋白质浓度，是运用蛋白质─染料結合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的迅速、敏捷的措施。這种蛋白质测定法具有超過其他几种措施的突出長处，因而正在得到广泛的应用。這一措施是目前敏捷度最高的蛋白质测定法。
考馬斯亮兰G-250染料在酸性溶液中為棕紅色，當它与蛋白质通過范德华键結合後，变為藍色。在酸性溶液中与蛋白质結合，使染料的最大吸取峰（lmax）的位置，由465nm变為595nm。且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，通過测定595nm处光吸取的增長量可知与其結合蛋白质的量。研究发現，染料重要是与蛋白质中的碱性氨基酸（尤其是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相結合。
考馬斯亮藍染色法的突出長处是：
（1）敏捷度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。這是由于蛋白质与染料結合後产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸取值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
（2）测定迅速、简便，只需加一种试剂。完毕一种样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质結合的過程，大概只要2分钟即可完毕，其颜色可以在1小時内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最佳。因而完全不用像Lowry法那样费時和严格地控制時间。
（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺陷是：
（1）由于多种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不一样，因此考馬斯亮藍染色法用于不一样蛋白质测定期有较大的偏差，在制作原则曲线時一般选用g—球蛋白為原则蛋白质，以減少這方面的偏差。
（2）仍有某些物质干扰此法的测定，重要的干扰物质有：去污剂、TritonX-100、拾二烷基硫酸钠（SDS）等。
三、材料、试剂与器具
?（一）、试剂：
考馬斯亮藍试剂：
考馬斯亮藍G—250100mg溶于50ml95%乙醇，加入100ml85%H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml,滤紙過滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考馬斯亮藍G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。
原则蛋白质溶液：
纯的牛血清血蛋白，预先經微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。
（二）原则和待测蛋白质溶液
1．原则蛋白质溶液
纯的牛血清血蛋白，预先經微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。
2．待测蛋白质溶液。
人血清，使用前用0.15mol/LNaCl稀释200倍。
（二）、器材：
1、试管1.5×15cm（×6）和试管架。
2、移液管管0.5mL（×2）；1mL（×2）；5mL（×1）；
3、可見光分光光度计。
（三）、原则曲线制作：
试管编号
0
1
2
3
4
5
未知
200ug/ml原则蛋白（ml）
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0.15mol/LNaCl（ml）
2
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
考馬斯亮藍试剂（ml）
6
6
6
6
6
6
摇匀，1h内以1号管為空白對照,在595nm处比色
蛋白质浓度（ug/ml）
0
5
10
15
20
25
A595nm
2、以A595nm為纵坐標，原则蛋白含量為横坐標（），在坐標轴上绘制原则曲线。
1）运用原则曲线查出回归方程。
2）用公式计算回归方程。
一般有关系数应過0.999以上，至少2個9以上。
4）、绘图時近两使點在一条直线上，在直线上的點应當在直线两侧。
（四）、蛋白质含量的测定：
样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），根据操作环节1操作，测出样品的A595nm，然後运用原则曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。
一般被测样品的A595nm值在0.1—0.5之间，因此上述样品假如A595nm值太大，可以稀释後再测A595nm值，然後再计算。
（五）、注意事项：
玻璃仪器要洗涤洁净。
取量要精确。
玻璃仪器要干燥，防止温度变化。
對照：用被测物质以外的物质作空白對照。
在试剂加入後的5－20min内测定光吸取，由于在這段時间内颜色是最稳定的。
测定中，蛋白－染料复合物會有少部分吸附于比色杯壁上，测定完後可用乙醇将藍色的比色杯洗洁净。
试验二、紫外吸取法测定核酸的含量
一、目的
1、熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用措施。
2、學习紫外分光光度法测定
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