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淀粉酶发酵实验方案

综合实验一α-淀粉酶的摇瓶发酵

一、实验目的

1、掌握微生物发酵的基本流程；

2、通过淀粉的发酵制过程掌握菌种制备、发酵过程控制、中间参数测定等基本

生物工程技术。

二、实验原理

1、枯草芽胞杆菌

2、DNS法测还原糖

3、α-淀粉酶活性测定

4、α-淀粉酶效价测定

三、仪器与材料

1、发酵培养基：葡萄糖（1.5%），玉米淀粉(0.2%)，酵母膏(0.02%)，蛋白胨(3%)，

氯化铵(0.01%)，硫酸镁(0.05%)，磷酸二氢钠(0.15%)，磷酸氢二钠(0.3%)；

2、菌种：枯草芽胞杆菌；

3、试剂：1mol/LNaOH，1mol/LHCl、pH6.0的磷酸缓冲液、葡萄糖标准液（1mg/mL）、

DNS溶液（棕色瓶储藏）、稀碘液、LB液体培养基（蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L，

氯化钠10g/L）等；

4、其它：天平，药匙，广泛pH试纸，玻璃棒，不锈钢烧杯，250ml的三角瓶，

纱布，报纸，棉线，电炉，电磁炉，带塞比色管，试管架，漏斗，1ml、5ml

移液管，洗瓶，废液瓶，蒸馏水，滤纸，比色皿，取液器，枪盒，枪头，酒

精灯，打火机，振荡培养箱，分光光度计，水浴锅等。

四、实验方法

1、菌种活化：将保藏的菌种转接到斜面培养基上，37℃培养24h；

2、种子液制备：取一环活化的菌种接入装量为50mL的种子培养基，37℃，180rpm

培养18h；

3、接种培养：分别取2ml种子液，接入到发酵培养集中固定置恒温振荡培养箱

中，32℃，160rpm培养48h.

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淀粉酶发酵实验方案

4、葡萄糖标准曲线的绘制

分别取葡萄糖标准液（1mg/ml）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于25ml带

塞比色管中，分别准确加入DNS试剂2ml，沸水浴加热2min，流水冷却，用

水补足到15ml刻度。在540nm波长下测定吸光度。

5、发酵液：取发酵液5ml，过滤，备用；

6、DNS测定：取发酵滤液适当稀释，使糖浓度为0.1-1.0mg/ml，取稀释后的糖

液1.0ml于15ml刻度试管中，加DNS试剂2.0ml，沸水煮沸2min，冷却后

用水补足到15ml刻度，在540nm波长下测定吸光度。从标准曲线查出葡萄

糖mg/ml数。求出样品中糖含量；

7、α-淀粉酶活性的测定：吸取20.0ml可溶性淀粉溶液于试管中，加入5.0ml

缓冲液摇匀后，于60±0.2℃恒温水浴中预热5min。加入稀释好的待测酶液

1.0ml，立刻计时，摇匀，准确反应5min。立即吸取1.0ml反应液，加到预

先盛有0.5ml盐酸溶液（0.1mol/ml）和5.0ml稀碘液中，摇匀，并以0.5ml

盐酸溶液（0.1mol/ml）和5.0ml稀碘液作空白，于660nm波长下，用10mm

比色皿迅速测定其吸光度（A），根据其吸光度查表（见表1），求得测试酶液

的浓度（cU/ml）.

8、淀粉酶效价测定：（1）配制淀粉培养基，2%淀粉，2%琼脂；（2）水解淀粉圈

实验：用打孔器在平皿中央打孔，取0.1ml不同时间取样的发酵液于孔中，

最后将平皿放置于30℃左右培养箱中培养并观察。

五、结果与分析

1、根据该实验，查阅资料，写出一种适合该发酵液中淀粉酶提取的实验方案。

2、记录0，12，24，36，48小时各时间段，pH、DNS、酶活值，分别以表格和

图形形式表示。

3、绘制淀粉酶效价（透明圈直径表示）变化曲线。

4、分析实验结果

淀粉酶发酵实验方案

DNS试剂：酒石酸钾钠18.2g，溶于50ml蒸馏水中，加热，于热溶液中依次

加入3，5-二硝基水杨酸0.03g，NaOH2.1g，苯酚0.5g