DB43T 987-2015 辣椒品种纯度鉴定SSR分子标记法.docxVIP

ICS65.020.20B05

DB43

湖南省地方标准

DB43/T987—2015

辣椒品种纯度鉴定SSR分子标记法

ProtocolforpurityidentificationofpeppervarietybySSRmolecularmarkers

2015-01-23发布2015-03-23实施

湖南省质量技术监督局发布

I

DB43/T987—2015

目次

前言 Ⅱ

1范围 1

2原理 1

3仪器设备、试剂和耗材 1

3.1主要仪器设备 1

3.2主要试剂 1

3.3主要耗材 1

4试剂配制 1

4.1DNA提取试剂 1

4.2PCR扩增试剂 2

4.3变性聚丙烯凝胶电泳试剂 2

4.4银染、显影试剂 2

4.5显影液 3

5引物 3

6操作步骤 3

6.1供试品种样品制备 3

6.2DNA提取 3

6.3PCR反应体系和程序 3

6.4变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 3

6.5染色和显色 4

7统计与计算 4

附录A（资料性附录）部分SSR引物信息 6

II

DB43/T987—2015

前言

本标准按照GB/G1.1—2009给出的规则起草。

本标准的某些内容可能涉及专利，本标准的发布机构不应承担识别这些专利的责任。本标准由湖南省农业标准化技术委员会提出并归口。

本标准主要起草单位：湖南省蔬菜研究所。

本标准主要起草人：郑井元、刘峰、邹学校、张竹青、马艳青、戴雄泽、李雪峰。

1

DB43/T987—2015

辣椒品种纯度鉴定SSR分子标记法

1范围

本标准规定了辣椒品种纯度SSR分子标记鉴定技术。

本标准适用于采用SSR分子标记法进行辣椒品种纯度鉴定。

2原理

简单重复序列（Simplesequencerepeats:SSR）随机分布于辣椒全基因组的不同位置上，不同品种或品系每个位点上重复单位的数量和序列可能不同，从而形成片段长度多态性。根据基因组中每个简单重复序列两侧序列的保守性，设计一对特异引物，利用PCR(PolymeraseChainRaction)技术进行扩增，扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，经硝酸银染色，从而判别PCR产物的电泳谱带，通过选用供试品种间具有广泛多态性的SSR引物，依据PCR扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳谱带差异，鉴定辣椒品种纯度。

3仪器设备、试剂和耗材

3.1主要仪器设备

研钵、液氮罐、电子天平、恒温水浴锅、高速台式离心机（14000r/min）、紫外分光光度计、高压灭菌锅、PCR扩增仪、电泳仪、垂直电泳槽、凝胶成像系统、酸度计、微量移液器、摇床、通风柜、数码相机、胶片观察灯、冰箱（4℃和-20℃)。

3.2主要试剂

乙二胺四乙酸二钠、盐酸、氢氧化钠、液氮、三羟甲基氨基甲烷、十二烷基磺酸钠、三氯甲烷、乙醇、异丙醇、异戊醇、dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)引物、TaqDNA聚合酶、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、硼酸、四甲基乙二胺、过硫酸铵、冰醋酸、硝酸银、甲醛、醋酸钠，所以试剂符合分析纯以上标准。

3.3主要耗材

离心管、移液枪枪头、96孔PCR扩增板、玻璃板、一次性手套、一次性口罩。

4试剂配制

4.1DNA提取试剂

4.1.10.5mol/LEDTA（乙二胺四乙酸二钠盐）（pH8.0）溶液

称EDTA186.1g，加入已有800mL双蒸水的烧杯中，用氢氧化钠调节pH值至8.0，补双蒸水

DB43/T987—2015

2

至1000mL

至1000mL

玻璃棒摇匀

分装至100mL的玻璃瓶中

灭菌后室温保存备用

,

,用，

,

。

4.1.21mol/LTris-HCl（三羟基氨基甲烷盐酸，pH8.0）溶液

称121.1gTris加入含有800mL双蒸水的烧杯中，用盐酸调节pH值至8.0，补双蒸水定容至1000mL，摇匀，4℃冰箱中保存备用。

4.1.3DNA提取液

取1mol/LTris-HCl溶液50mL、0.5mol/LEDTA溶液20mL，称SDS7.5g和NaCl14.6g加入到500