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谷子半胱氨酸合成酶基因家族克隆及遗传转化体系建立

中文摘要

谷子（Setariaitalica）是禾本科重要的生物能源作物，广泛分布于亚洲、非洲等干

旱地区，具有很强的耐旱性。谷子具有较小的基因组、较强抗旱性和高效的水分利用率、

生育期短、种植管理方便等特点，正快速成为C4植物的模式作物。谷子的遗传转化难

度较大，目前只在几个品种中取得成功，是限制谷子快速开展深入研究的重要障碍。

半胱氨酸合成酶（cysteinesynthase，CS）是一种广泛存在于微生物和植物细胞中的

合成半胱氨酸的关键酶，含有动物必需的硫元素，所以动物只能通过摄取植物或微生物

中的有机硫来满足自身体内对硫元素的需求，是自然界硫循环过程中的关键反应酶。本

研究以谷子中半胱氨酸合成酶基因家族作为研究对象，运用生物信息学分析、RT-qPCR

克隆分析谷子CS家族基因，构建及优化晋谷21号瞬时及稳定转化体系、原核表达谷子

半胱氨酸合成酶及胁迫表达等手段解析谷子半胱氨酸合成酶基因家族在晋谷21号中的

功能。现得到如下实验结果：

1.谷子CS基因家族鉴定与分析。本实验在谷子基因组中鉴定了11个半胱氨酸合成

酶基因，并进行了基因结构、染色体定位、系统发育分析、SiCS基因家族编码的蛋白序

列分析、亚细胞定位预测。结果显示，SiCS基因家族编码的蛋白分子量在

30361.03-48603.99Da；等电点在5.28-8.91之间；均无信号肽；仅SiCS11含有跨膜结构

域。此外，对SiCS3进行烟草亚细胞定位，结果与预测结果相同，定位在细胞质中。

2.SiCS基因家族克隆及表达模式分析。组织表达模式分析显示，在成熟期的茎中

SiCS基因家族表达量相对较高，而SiCS3在全发育时期根茎叶穗中均有表达，表明该基

因可以在谷子全发育时期稳定发挥作用。此外，从晋谷21号中克隆出SiCS基因家族，

序列全长为982-1207bp，氨基酸数目在281-451之间。

3.构建SiCS3原核表达载体，并对其进行胁迫实验验证，结果表明含有SiCS3基因

质粒的大肠杆菌在PEG模拟干旱、NaCl模拟盐胁迫、冷处理及热处理条件下仍然生长

状态良好，间接说明SiCS基因家族可能参与干旱、盐、冷及热的胁迫响应。

4.构建谷子胚性愈伤瞬时表达体系。通过单因素分析了谷子稳定遗传转化过程中对

I

侵染效率有影响的关键参数，包括对胚性愈伤进行物理处理、农杆菌菌株及浓度、添加

AS浓度、侵染时间及共培养时间等因素，并通过提取胚性愈伤中的GUS蛋白及GUS

酶活检测。结果显示：在胚性愈伤提前于42℃处理5min，使用OD为0.3A的EHA105

600

菌株的农杆菌，添加150µMAS的侵染液重悬后侵染胚性愈伤20min的条件下瞬时表

达GUS蛋白效果最佳，侵染效率最高。

5.对晋谷21号稳定遗传转化的体系的优化，并使用过表达SiCS3基因的农杆菌转化

晋谷21号。选择晋谷21号瞬时转化中侵染效率最高的方法，将其运用至晋谷21号的

稳定遗传转化，同时对稳定遗传转化中的胚性愈伤组织及植株进行潮霉素耐受浓度进行

筛选。最终确定以添加50mg/L的潮霉素作为转化后的抗性愈伤筛选标准，添加25mg/L

的潮霉素作为阳性植株的筛选标准，上述条件下阳性愈伤的转化效率为40.48%。

本研究实验从多层次研究了晋谷21号半胱氨酸合成酶的生物学特性及晋谷21号的

遗传转化体系的构建，为后续进一步研究谷子半胱氨酸合成酶提供理论依据。

关键词：晋谷21号；半胱氨酸合成酶；瞬时遗传转化；稳定遗传转化

II

Cloningofcysteinesynthasegenefamilyandestablishmentof

genetictransformationsysteminfoxtailmillet

Abstract

Millet(Setariaitalica)isanimportantbio-energycropinG