食品分析第十一章-蛋白质和氨基酸的测定.pptVIP

二、双缩脲法1.原理脲（尿素）NH2—CO—NH2加热至150~160℃时，两个分子间脱去一个氨分子生成双缩脲。NH2—CO—NH2+NH2—CO—NH2NH2—CO—NH—CO—NH2+NH3双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物，这种反应叫双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键—CO—NH—与双缩脲结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确定含量；该配合物的最大吸收波长为560nm。2.方法特点及应用范围本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。三．紫外吸收法1.原理蛋白质及其降解产物的芳香环残基在紫外区内对一定波长的光有吸收作用。在280nm下，吸光度与蛋白质浓度成直线关系。│R（—NH—CH—CO）2．适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰因素多，故在食品分析领域应用不广泛。四、福林-酚比色法原理：蛋白质与福林-酚试剂反应，产生蓝色复合物。作用机理主要是蛋白质中的肽键与碱性铜盐产生双缩脲反应，同时由于蛋白质中存在酪氨酸与色氨酸同磷钼酸-磷钨酸试剂显色。颜色深浅与蛋白质含量呈正比。福林酚法灵敏度高，实测下限较双缩脲法约小2个数量级。五、考马斯亮蓝染料比色法原理：考马斯亮蓝G250是一种蛋白质染料，与蛋白质通过范德华力结合，使蛋白质染色，在620nm处有最大吸收，可定量测定蛋白质。此法简单快速，不受酚类、游离氨基酸和小分子的影响，灵敏度和福林-酚相似。六、染料结合法原理：在特定条件下，蛋白质可与某些染料定量结合而生成沉淀，用分光光度计测定沉淀反应完成后剩余的染料量，可计算出反应消耗的染料量，从而计算出样品中蛋白质含量。适用范围：适用牛乳、冰淇淋、酪乳、巧克力饮料、脱脂乳粉等食品。§4氨基酸的定量测定一．氨基酸的一般定量测定（一）甲醛滴定法原理：氨基酸本身有碱性—NH2—基，又有酸性—COOH基，成中性内盐，加入甲醛溶液后，甲醛与—NH2—结合，碱性消失，再用强碱来滴定—COOH基。特点：适用于发酵工业，如发酵液中含氮量，其发酵过程中氮量减少情况等。（适于食品中游离氨基酸的测定）样液中有其他的酸性物质使测定结果不准确；3．双指示剂：①40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将40%甲醛中和至蓝色。②0.1%百里酚酞乙醇溶液，③0.1%中性红50%乙醇溶液，④0.1mol/L氢氧化钠标准溶液。4．操作：同时取两份样：①+中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴，中和样液中其它酸性物质。②+百里酚酞+中性甲醛+NaOH滴，中和了样液中氨基酸的羧基与其它酸性物质的总和。二者之差可计算氨基酸含量（二）电位滴定法原理：根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插入被测液中构成原电池，用氢氧化钠标准溶液滴定，依据酸度计指示的PH值判定滴定终点。（三）茚三酮的比色法原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应，生成蓝紫色化合物（除脯氨酸外均有此反应），可用吸光光度法测定。最大吸收波长为570nm。§5氨基酸的分离与测定一．薄层色谱法（薄层层析法（TLC法）近年来发展起来的一种微量而快速的层析方法，它把吸附剂或支持剂均匀的铺在玻璃板上成一薄层，把样品点在薄层上，然后用合适的溶剂展开，从而达到分离、鉴定和定量的目的。因为层析在薄层上进行，所以称为薄层层析。它的应用范围比纸层析更广泛，常用来分析氨基酸、农药残留量、黄曲霉毒素等。（一）原理：

取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有相同的Rf值，不同成分则有不同的Rf值，因而各种混合物可达到彼此被分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以大致确定其含量。

Rf=a/b为定值，与不同物质在两相溶液中的分配系数相关。ab样点溶剂前沿点样原点优点：①展开时间短，一般在20