细胞凋亡流式检测对流式管路的影响分析.pdfVIP

勿以恶小而为之，勿以善小而不为。——刘备

细胞凋亡流式检测对流式管路的影响分析

工作原理：

正常细胞的表面由不对称分布在质膜内叶和外叶上的脂质组成。

这些脂质之一磷脂酰丝氨酸（PS），通常仅分布于质膜的内叶，因此

仅暴露于细胞质中。然而，在细胞凋亡过程中，脂质不对称性消失并

且PS暴露在质膜的外部小叶上。AnnexinV是一种36kDa的钙依

赖性的磷脂结合蛋白，能够与PS结合。因此，荧光标记的AnnexinV

可用于检测暴露于早期凋亡细胞外部的PS。AnnexinV还可以染坏死

细胞，因为这些细胞的膜破裂，使AnnexinV可以进入整个质膜，但

是AnnexinV就无法区分坏细胞死（中晚期凋亡细胞）和早期凋亡细

胞。因此，通过与碘化丙啶（PI）共染色，可以将凋亡细胞与坏死细

胞（中晚期凋亡细胞）区分开，因为早期凋亡细胞和活细胞的细胞膜

仍然完整，PI能进入坏死细胞（中晚期凋亡细胞）但是被早期凋亡

细胞排除在外。该方案描述通过AnnexinV结合和PI摄取，然后通

过流式细胞仪检测和量化凋亡细胞。

AnnexinV/PI染色方法：

1）根据细胞类型，选择合适的细胞板接种培养目的细胞；

2）用细胞毒性刺激物处理细胞或通过紫外线辐射触发贴壁细胞

死亡，使用明场显微镜观察细胞；

3）收集细胞，将1×105个细胞重悬于200μLBindingBuffer

中，加入4μL0.5mg/mLPI和2μLAnnexinV-FITC溶液；

4）避光室温孵育15min；

勿以恶小而为之，勿以善小而不为。——刘备

5）用流式细胞仪进行荧光检测。（AnnexinV-FITC最大激发光

为488nm，发射光为520nm。PI最大激发光为～535nm，发射光为

617nm。但是，两者都可以被488nm激光激发。）

流式细胞术检测：

通过AnnexinV结合和PI摄取来测量细胞死亡。（A）以漫画形

式描述凋亡细胞AnnexinV结合和PI摄取。（i）磷脂酰丝氨酸（PS）

位于活细胞完整质膜的内部小叶上，这些细胞不会被AnnexinV和

PI染色。（ii）PS翻转到凋亡细胞质膜的外部小叶，这些细胞在外

部结合AnnexinV，但仍不被PI染色。（iii）继发性坏死细胞（中

晚期凋亡细胞）膜破裂，AnnexinV与质膜上的PS结合，PI被吸收

并与DNA结合。（B）在流式数据的点图中（左侧）以及在用放线菌

素D（1μM）处理16h并用AnnexinV染色的U937细胞的点图中观

察到i，ii和iii中的种群的地方AnnexinV-FITC和PI（右侧）。

实验过程中的小建议（大作用）：

1）要准备阴性对照（不加染料）、阳性对照（同时加两种染料）

和单染样品（分别只加一种染料），阳性对照和单染样品细胞可以

55℃水浴10min或用凋亡诱导剂诱导细胞凋亡。

2）细胞凋亡检测的是活细胞，切勿用甲醛固定，尽量避免酶消

化时间过长或用力吹打产生细胞碎片，重悬细胞后尽快上机检测。

3）AnnexinV的结合依赖于钙离子，所以消化液中避免含有EDTA，

否则会影响AnnexinV与PS的结合。

4）AnnexinV的结合不稳定，所以需要在标记时确保使用含钙

勿以恶小而为之，勿以善小而不为。—