遗传信息传递—基因重组与基因工程(生物化学课件).pptx

自然界的基因转移和重组;DNA重组;发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。;Holliday模型中，同源重组的4个关键步骤;片段重组体

切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。;;;;二、细菌的基因转移与重组;可接合质粒如F因子(Ffactor);（二）转化作用;例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。;（三）转导作用;λ噬菌体的生活史;;转导过程;;;;（三）免疫球蛋白基因的重排;重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重排的重组酶基因rag(recombinationactivatinggene)共有两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。;;四、转座重组;插入序列(insertionsequences,IS)组成：

二个反向重复序列(invertedrepeats,IR)

侧翼的正向重复序列

一个转座酶（transposase)编码基因;插入序列的复制性转座;转座子(transposons)——可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。

转座子组成：反向重复序列

转座酶编码基因

抗生素抗性等有用的基因;由转座子介导的转座;重组DNA技术;重组DNA技术的发展史;;一、重组DNA技术相关概念;DNA克隆

应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。;生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等。;（二）工具酶;重组DNA技术中常用的工具酶;限制性核酸内切酶;作用：

与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；

第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；

第四个字母代表株；

用罗马数字表示发现的先后次序。;Ⅱ类酶识别序列特点：

——回文结构(palindrome);;有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。;（三）目的基因;（四）基因载体;克隆载体(cloningvector)

为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。

表达载体(expressionvector)

为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。;载体的选择标准;1.质粒(plasmid);λ噬菌体DNA改造系统

λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）

EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）;??????????????????????????????????????????????????????????????

MultipleCloningSites

;3.柯斯质粒(cosmid);酵母人工染色体

(yeastartificialchromosome,YAC)

动物病毒DNA改造的载体

腺病毒载体

逆转录病毒载体

杆状病毒载体;二、重组DNA技术基本原理;以

质

粒

为

载

体

的

DNA

克

隆

过

程;（一）目的基因的获取;1.化学合成法;组织或细胞染色体DNA;;mRNA;是一种在体外利用酶促反应大量获得特异序列的基因组DNA或cDNA的专门技术，又称为无细胞的分子克隆。;模板DNA

引物

4种dNTP

TaqDNA聚合酶

含Mg2+的缓冲液。;（1）变性，加热至95℃，使模板DNA解开成单链；

（2）退火，温度降至适宜，使引物与模板互补结合；

（3）延伸，温度升至72℃，DNA聚合酶以4种dNTP为底物，在引物的3’-OH上，合成与模板互补的DNA新链。;

;;（三）外源基因与载体的连接;;不同限制酶切位点的连接;2.平端连接

适用于：限制性内切酶切割产生的平端

粘端补齐或切平形成的平端;;