DEAE纤维素离子交换层析法分离血清蛋白.pptx

实验八

DEAE纤维素离子交换层析法分离血清蛋白;实验目的;思考题;实验原理;平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。;DEAE纤维素(二乙基氨基乙基，Dicthylaminoethyl，DEAE)是阴离子交换剂。在pH8.0的溶液中，血清蛋白质都解离成为阴离子，可交换结合到DEAE纤维素离子交换层析柱上。

然后用梯度洗脱法，即逐步改变洗脱液的pH值与离子强度使DEAE纤维素与蛋白质的亲和力降低，可使不同蛋白质按其亲和力的大小不同而分步洗脱下来，从而达到分离提纯的目的。;762分光光度计、梯度发生器、磁力搅拌器、量筒、漏斗、烧杯、试管、乳头吸管、移液管、玻璃棒、尼龙布、螺旋夹。;实验操作;将纤维素放到250ml的烧杯中，加40ml0.5NNaOH浸泡30分钟，弃上清。加蒸馏水100ml，搅拌后倾入有尼龙滤布的漏斗中。用蒸馏水充分洗涤，直到流出液pH≤8，滤去水分。

将上述纤维素放入250ml烧杯中，加入100ml0.01mol/LNa2HPO4浸泡并搅动。必要时再重复此操作到溶液pH=8为止。;实验步骤;4、加样

当液面恰好与凝胶面重合时，立即拧紧螺旋夹，用枪向界面缓慢的加入血清0.2ml，打开柱下口，液体缓慢流出。

当全部血清恰好完全渗到纤维素柱界面时，立即小心地加0.01mol/LNa2HPO4缓冲液0.5ml。连上乳胶管胶塞。;5、洗脱

拧松梯度发生器盛液桶间的螺旋夹。开动磁力搅拌器，（搅拌速度不宜过快，以免空气卷入液内）。将连接梯度发生器出口的细胶管连接管上，使液体流入层析管内。

拧松层析柱下端胶管的螺旋夹，控制流速约15滴/分，使洗脱液滴入收集管内。每管收集到约3ml，换管。收集完为止（15~20个管）。

6、检测

用分光光度计测280nm光密度值（以0.01ml/LNa2HPO4液作空白管）。

以光密度为纵坐标，管号为横坐标，用方格坐标纸绘出血清蛋白层析谱。观察并判断结果。

注：洗脱开始时先用1个体积的0.01mol/LNa2HPO4起始（100ml）洗脱，然后再进行梯度洗脱???加样后即开始收集，每管约3ml。;7、作图;;结束！