细胞培养，WB补充[含答案].pdfVIP

➕

细胞培养贴壁细胞

细胞复苏：

准备工作：水浴锅37c预热，15ml离心管预先加3～5ml培养基

1.从-80c取出细胞，套在海绵漂中，在预热的水浴锅中震荡溶解

（37c，溶解时间最好小于1min，冻存管内仍有少许冰为佳）

2.将细胞液吸入预先加入培养基的15ml离心管，1500rpm，5min离心（注意

配平）

注：也可PBS重悬后再次离心（为了洗掉残留冻存液）

3.1ml培养基重悬细胞，根据离心的细胞量选择适合的皿，接种到皿里，补

体系（中皿3ml，大皿7ml）

4.十字摇匀后显微镜观察，放入培养箱。

细胞换液：

1.弃掉旧培养基，加PBS洗一遍（1-3ml都可）

2.弃掉PBS，加培养基，体系同上。

细胞传代：

1.弃掉旧的培养基，PBS洗一遍，弃掉PBS。

2.加1ml或500ul胰酶（一般覆盖细胞即可），培养箱培养3min（不同细胞

时间不同，需要摸索）。

3.用1ml枪吹打，观察细胞是否能吹掉，若可以则加2倍培养基中和后继续

吹打，吹落后移入15ml离心管离心，若不可以则再孵育一段时间后再次吹

打。也可每隔1分钟镜下观察细胞是否变圆，记录最佳消化时间，以备下次

使用。

4.1500rpm，5min离心，用3ml培养基重悬（培养基体系根据自己情况而

定）。

5.接种到皿里（传代比一般为1:2～1:3），放入培养箱

细胞冻存：

离心前步骤同传代，离心后用1ml冻存液500ul血清混匀后，重悬细胞移

入冻存管，贴上封口膜，放入-80∞冰箱冻存。

计数：离心后，1ml重悬，取100或10ul细胞悬液900或90ulPBS进行稀释

（相当于稀释10倍），取10ul打入计数板进行计数。如何计参考前面笔记

附加事项

1.水浴锅提前预热

2.离心时注意配平

3.一般生长稳定的细胞2-3天换液一次，生长缓慢的细胞可3-4天换液

一次。（具体情况具体分析）

b.观察细胞生长状态，细胞长满瓶底的80-90%，应及时传代。

c.观察细胞形态变化，细胞透明度大、折光性强、轮廓清晰为佳。

4.为细胞换液时，要沿着培养瓶的一侧轻轻地加入，而不是直接加到细

胞中，以免损伤细胞，当培养的细胞株较为脆弱时尤其需要注意。

内参的作用和选择

1、内参：即内部对照，一般是指由管家基因编码表达的蛋白，它们在各

组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用来作为

内参。

2、内参的作用：校正蛋白定量、上样过程中存在的误差，排除上样量

的影响，从而保证实验结果的准确性（前提是等量的上样体积）

内参亦可作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个蛋白免疫印

迹显色发光体系是否正常。

3、内参的选择：

种属来源：哺乳动物的样本需要选择哺乳动物中稳定表达的蛋白作为内

参；植物样本需要选择植物中稳定表达的蛋白做内参；

哺乳动物的组织或者细胞样本：通常选择β-actin、β-tubulin、

GAPDH、LaminB、HistoneH3等。其他最好参考文献。

细胞定位：靶标蛋白的细胞定位不同，适合的内参也不同。针对一般

蛋白质检测，GAPDH、β-actin或β-tubulin即可满足，而检测亚细胞

器蛋白时，适宜的选择更能体现其准确性。（如常用的核内参抗体有Lamin

A、LaminB、TBP、YY1、HistoneH3。常用的膜内参抗体为ATP1A1。对于线粒体

则常用VDAC1和COXIV作为内参抗体。）

分子量：内参蛋白的分子量需要与目标蛋白有所区别，否则两者条带无

法分开。一般目的蛋白与内参蛋白大小至少相差5kDa以上；（比如目的蛋

白分子量为45kDa，此时不适宜选择β-actin作为内参，可以考虑选择GAPDH或者

β-tubulin作为内参。）

表达因素：内参的选择还需要考虑实际的实验环境。GAPDH是代谢类

蛋白