2025年生物化学实验报告创新指南.docxVIP

南方医科大

学

生物化学试验汇报

姓名：许梨梨

学号：

专业年级：级医学影像学

组别：第3试验室

生物化学与分子生物学试验教学中心

试验名称氨基酸的薄层层析

试验日期-10-24试验地点第3试验室

合作者许琮指导老师何肖娟

评分教师签名批改日期

一、试验目的

1.掌握薄层层析法的一般原理。

2.掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。

3.掌握怎样根据移动速率(Rf值)来鉴定被分离的物质(即氨基酸混合液)。

二、试验原理

(一)薄层层析法

薄层层析法是色谱分析技术的一种，一般将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液体(展开溶剂)在固定相上流动时，由于吸附剂对不一样氨基酸的吸附力不一样样，不一样氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样样，点在薄板上的混合氨基酸样品伴随展开剂的移动速率也不一样，因而可以将样品各组分分离开。即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来。

吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶。层析用硅胶是一种多孔性物质，它的硅氧环交链构造表面上密布极性硅醇基，这种极性的硅醇基能和许多化合物形成氢键而产生吸附。

本试验采用硅胶吸附薄层层析。硅胶吸附薄层层析的特点：1.硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活性也与含水量呈负性有关。2.硅醇基显较弱的酸性，因而，硅胶只能用于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它分离。3.硅胶的活化温度一般为105℃-110℃,不能过高。

(二)氨基酸与茚三酮的显色反应

茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸发生羧基反应生成还原茚三酮、氨基酸，与此同步。还原茚三酮又与氨基茚三酮缩合生成紫红色化合物而使氨基酸斑点显色。

(三)相对迁移率—Rf值的计算

混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置用相对迁移率—Rf值(rateofflow)来表

达。

层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值。

由于物质在一定溶剂中的分派系数是一定的，故移动速率(Rf值)也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。

三、材料与措施：

(一)试验材料

1.分析样品：(1)混合氨基酸溶液

(2)氨基酸的异丙醇溶液：丙氨酸、精氨酸、甘氨酸。2.试剂：(1)吸附剂：硅胶；

(2)黏合剂：0.5%的羧甲基纤维素钠；

(3)展层-显色剂：为正丁醇、乙醇、茚三酮、丙酮、蒸馏水混合液；3.仪器及器材：(1)层析板(5*15cm);(2)小烧杯及药匙；(3)量筒(10ml);

(4)小尺子和铅笔；(5)毛细玻璃管；(6)层析缸；(7)烘箱；(8)天平

(二)试验措施

1.试验流程：

干燥

干燥活化点样

点样

层析显色

调浆涂布

标识

制板

2.操作环节：

①调浆：称取硅胶3.5克，加0.5%的羧甲基纤维素钠8mL,调成均匀的糊状；

比

制板②涂布：取洁净的干燥玻璃板均匀涂层；

制板

③干燥：将玻璃板水平放置。室温下放置30分钟以上，自然晾干；

④活化：70℃烘干30min。切断电源，待玻璃板面温度下降至不烫手时取出。

①标识：用铅笔在距底边2

①标识：用铅笔在距底边2cm处画上条水平线，在线上均匀确定4个点并做好标识，每个样品间相距1cm。

点样

②点样：用毛细管分别吸取丙氨酸、精氨酸、甘氨酸及混合氨基酸溶液，取样量为毛细管柱高2cm。轻轻接触薄层表面点样。加样原点扩散直径不超过2mm。点样后自然晾干，必要时反复加样。

将薄层板点样端浸入展层-显色剂，展层-显色剂液面应低于点样线。盖好层析缸盖(层析缸盖上涂上凡士林防止层析液挥发),上行展层。当展层剂前沿抵达薄层板中间部分时，即可停止展层，取出薄板，用铅笔描出前沿界线。

将薄板置于烘箱中，在70℃烘干30分钟，即可显出各层斑点。

层析

显色

四、成果与讨论：

(一)成果

1.试验现象

(1)层析时，能清晰地看到展层-显色剂在层析板上运动的痕迹。通过计时及观测展层剂前沿的位置，可以大体看出展层剂前沿的移动速率随前沿所处高度的增长而减缓。目前缘抵达层析板中间部位时，能观测到展层剂前沿移动的速率变得非常缓慢。

(2)层析过程中层析板上没有显色现象。打开层析缸能闻见浓烈的丙酮味。

(3)在烘箱内烘烤10分钟左右时，即可见层析板上开始显现紫红色的斑点，并且斑点颜色在一定期间范围内随时间的增长而加深。丙氨酸的斑点最高，颜色深浅介于甘氨酸和精氨酸之间；甘氨酸斑