2025年生物化学实验高效氨基酸成分分析操作指南.docxVIP

试验名称

(TitleofExperimetn)

氨基酸薄层层析

试验日期

(DateofExperiment)

试验地点(LabNo.)

合作者(Partner)

指导老师(Instructor)

总分

(TotalSooro)

XX

教师签名(Signature)

孪某某

批改日期

Date)

【试验汇报第一部分(预习汇报内容):①试验原理、②试验材料(包括试验样品、重要试剂、重要仪器与器材)、③试验环节(包括试验流程、操作环节和注意事项);评分(满分30分):

XX

一、预习汇报试验原理：

层析(chromatography):运用混合物各组分物理化学性质的差异，将多组分混合物进行分离及测定的措施。

固定相(stationaryphase)

层析体质的一种基质。能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、互换等作用。

流动相(mobilephase)

在层析过程中推进固定相上贷分离的物质朝着一种方向运动的液体或气体。

迁移率(rateofflow,Rf)

一定条件下，在特定期间内某一组份在固定相移动的距离与流动相自身移动的距离之比值，Rf值≤1。

层析原理：层析体系由一种固定相和一种流动相构成。流动相对固定相做相对运动，从而推进待分离的混合物样品通过固定相向前移动。样品中各组份物理化学性质不一样，与两相发生互相作用的能力不一样，被流动相推进前进时受到的阻力和移动速度不一样，一定期间后，不一样组份就可以在固定相上分离。

根据固定相基质的形式，层析可分为纸层析、薄层层析和柱层析。薄层层析是在玻璃或塑料等光滑表面铺一层很薄的基质进行层析。

薄层层析(thinlayerchromatography,TLC):是将吸附剂均匀地在玻璃板上铺成薄层(固

定相),再把样品点在薄层板一端，再把板的这端浸入合适的溶剂(流动相)在薄层板上扩展。并在此过程中通过吸附——解吸附——再吸附——再解吸附的反复进行，而将样品各组份分离出来。

本次试验：

●详细原理：当流动相在固定相上流动时，由于吸附剂对不一样氨基酸的吸附力不一样样，不一样氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样样，点在薄板上的混合氨基酸样品伴随展开剂的移动速率也不一样，因而可以彼此分开。

●吸附剂(固定相):硅胶(C.P.)。为使制成的薄层板不易松散，加入5%羟甲基纤维素

钠(CMCNa)作黏合剂。

●展开剂：正丁醇、冰醋酸和蒸馏水的混合液(80:10:10,V/V/V)。

●展层-显色剂：按照10:1比例(V/V)混匀的展开剂和0.1%茚三酮溶液。

●活化(activation):在一定温度下，对吸附剂硅胶加热清除水分。可使硅胶的活性提高，吸附能力加强。

●氨基酸与茚三酮的显色反应：茚三酮水化后生成的水合茚三酮在加热时被还原，此产物与氨基酸加热分解产生的氨结合，以及另一分子水合茚三酮缩合生成紫红色化合物而使氨基酸斑点显色。

●Rf值：

由于物质在一定溶剂中的分派系数是一定的，故移动速率(Rf值)也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。

试验材料：●样品：

1、0.01mol/L丙氨酸；

2、0.01mol/L精氨酸；

3、0.01mol/L甘氨酸；

4、混合氨基酸溶液。●试剂：

1、硅胶(C.P.)

2、0.5%羟甲基纤维素钠(CMCNa)

3、层展-显色剂：按照10:1比例(V/V)混匀的展开剂(正丁醇、冰醋酸和蒸馏水的混合液(80:10:10,V/V/V))和0.1%茚三酮溶液。

●仪器及器材：

1、层析版(6cm×15cm)

2、小烧杯

3、量筒(10ml)

4、刻度尺

5、铅笔

6、毛细玻璃管

7、层析缸

8、烘箱

9、天平

10、药匙

试验环节：

●试验流程：

点样层析显色制版

点样

层析

显色

●操作环节：

环节

操作

(1)制板

①调浆：称取硅胶3g,加入0.5%羟甲基纤维素钠8ml,调成均匀的糊状

②涂布：取洁净的干燥玻璃板涂层并涂抹震荡均匀

③干燥：将玻璃板水平放置，室温下放置0.5h,自然晾干至表面没有明显水渍

④活化：70°C烘干60min

(2)点样

①标识：用铅笔距底边2cm水平线上均匀确定4个点并做好标识。每个样品间相距1cm

②点样：用毛细玻璃管分别吸取0.01mol/L丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、混合氨基酸溶液，轻轻接触薄层表面点样。加样原点扩散直径不超过2mm

(3)层析

将薄层板点样端浸入展层-显色剂，展层-显色剂液面应低于点样线。盖好层析缸盖，上行展层。当层展剂前沿抵达薄板二分之一时，停止展层，取出薄板，用铅笔描出溶剂的前沿界线。

(4)显色

90℃下烘干30min,即可显出各层斑点