大肠杆菌感受态细胞及其制备.pptVIP

感受态因子：一种胞外蛋白，通过催化外来DNA吸附或者降解细胞表面的某种物质，从而使细胞表面的DNA受体暴露。（可能是一种自溶酶，可以特异性的结合双链DNA）同时Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上。当42度热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，为DNA分子提供进入细胞的通道。总的来说就是细胞在低温Ca2+等因子诱导下,细胞膜通透性发生改变,膜通透性的改变使细胞可以摄取DNA。感受态的制备细胞处于能够吸收外源DNA的状态称感受态，经特殊处理后处于此状态的细胞称感受体细胞。作为感受态细胞应具备什么特点？细胞表面暴露出一些可接受外来DNA的位点（以溶菌酶处理，可促使受体细胞的接受位点充分暴露）*。细胞膜通透性增加（用钙离子处理，可使膜通透性增加，使DNA直接穿过质膜进入细胞）。受体细胞的修饰酶活性最高，而限制酶活性最低，使转入的DNA分子不易被切除或破坏。将构建好的载体转入感受态细胞进行表达(转化)，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。制备感受态的方法电击法化学方法01CaCl2制备法氯化锂制备法（毕氏酵母）02电击法与CaCl2制备法的区别1原理：电击法:利用瞬时高压电流（数千伏特）处理细胞悬浮液，使微生物细胞膜在高压电作用下发生去极化，产生微孔，悬液中溶解的核酸即可通过细胞膜上的空洞进入细胞内部。CaCl2法:利用低渗溶液处理细胞悬浮液微生物细胞膜结构发生变化，使得细胞在热激时（42℃，90s）变得很容易从溶液中摄取DNA。2其他：01做电击转化时，悬液中会有大部分细胞会因电击而死亡，但是这种方法很直接，转化效率很高。另外，需要专门的仪器。02化学转化法操作简单，不需要特殊设备，转化效率足以满足一般克隆实验的需要，故使用范围非常广。03下面详细介绍CaCl2制备法。04CaCl2制备法原理01在CaCl2溶液中，细胞会发生膨胀，Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞。02仪器及设备高速冷冻离心机、超净台、冰盒、冰若干等。离心杯、移液器、吸嘴、EP管、自封袋等。培养基及试剂液体LB培养基、无抗平板、Amp平板、带Amp抗性的质粒、100mMCaCl2溶液（含15%甘油）。准备工作所有使用的移液器、吸嘴、离心杯、EP管以及装培养基的容器最好是专用。01洗涤容器时用水清洗干净，尽量不要用洗涤剂（洗涤剂一般含有表面活性剂而表面活性剂对感受态影响很大）02离心杯、EP管灭菌后置于-20℃预冷备用。03自封袋写上感受态名称、批号。04划板从-80℃冰柜中，取出一支冻存菌株，于事先照过紫外的超净台中，用无菌的接种环轻轻蘸取菌种后，在无抗平板上划线，并将菌种迅速放回-80℃保存。在划线板上做好相应标记，于37℃培养16-20小时。接种在照过紫外的超净台中，用灼烧并冷却后的镊子夹住一个20μl枪头（或者灭过菌的牙签），挑取单克隆，放入装有LB的试管中，将试管置于37℃恒温摇床培养10-12小时。将过夜菌按比例转接至准备好的液体培养基中。一般转接菌液与培养基体积比例不得大于１:１０，即转接菌液:培养基体积≦１:１０培养基体积与三角瓶体积比不得小于１:５，即培养基体积:三角瓶体积≧１:５要有足够的空间提供溶氧。转接完成后，置于37℃，220r/min培养1小时左右。检测OD600值，一般OD600值不要超过0.6，也不要低于0.2。OD值是一个重要的参数，当OD600值大于一定值时，菌体不会保持对数生长。同时，OD值大时菌体总量达，所以需要在这两个方面的影响中找到一个平衡点。不同的菌种所对应的值不一样。注：划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板和多接一根试管，划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。010203离心01操作过程中低温有助于感受态的形成，以下步骤都需快速在冰上操作，并严防污染！将达到浓度的菌液在超净台中转移到事先于-20℃预冷的离心杯中。将装有菌液的离心杯置于冰上10min，使菌液迅速冷却。02取出冷却后的离心杯，配平后对称放入冷冻离心机，4000r/min，4℃，离心15min。此时可以将CaCl2溶液放入-20℃预冷（CaCl2溶液不要放太早，否则会冻住，冷冻结晶后的CaCl2溶液最好弃去）。不同菌种，离心的转速和时间可以酌情更改。离心结束后，小心倒去上清，加入0.2倍菌液体积的预冷CaCl2