皮肤科细胞培养及临床应用.pptVIP

细胞培养中的其它用液平衡盐溶液PBSHank’s液D-Hank’s液-----消化液1胰酶溶液(0.1～0.25%)2D-Hank’s液配制3最佳pH值：8～94EDTA溶液(0.02%)5用于解离细胞(破坏细胞间的连接)6与胰酶混合用于消化贴壁牢的细胞7胶原酶溶液(0.1～0.3mg/L)8不易损伤细胞，不受Ca2+、Mg2+及血清抑制9细胞培养的生长测定**血细胞计数法01细胞密度(个/ml)=平均细胞数×104×稀释倍数影响方法精确性的因素02贴壁细胞消化的时间细胞悬液的均匀性细胞浓度合适03台盼蓝染色法**正常细胞不染色，死亡细胞呈蓝色。1细胞活力(%)=(总细胞数-着色细胞数)÷总细2胞数×100%3注意4为一种粗略的检测存活细胞的方法，5不能准确放映细胞活力差异。6判断时间7MTT比色法**01活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶催化四甲基偶氮02唑盐(MTT)，还原成紫色不溶性结晶物，沉积03于细胞中。用酸性异丙醇或DMSO溶解后，于04酶标仪上测定光吸收值。紫色不溶性结晶物形05成的多少与活细胞数目和功能状态相关。06细胞存活率=试验组光吸收值÷对照组光吸收值×100%07MTT法特点08高浓度血清的影响09简便迅速。10不接触同位素，敏感性与同位素法接近。细胞生长曲线法**可观察同一代细胞的增殖过程。根据生长曲线分析细胞增殖速度，确定具体实验﹑细胞传代的最佳时间。方法总培养时间7天计数每24小时细胞数目绘制细胞生长曲线潜伏期原代细胞24-96h传代细胞6-24h对数生长期3-5d倍增时间停滞期3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷掺入到细胞新合成的DNA中，通过测定3H放射性脉冲数，计算细胞的增殖活性。3H-TdR掺入法被标记的细胞为S期细胞，3H-TdR掺入量放映DNA合成的快慢。放射性损害。需要特殊实验室和特殊设备。特点细胞培养中的传代换液问题**原代培养后的第一次传代原代培养方法细胞活性细胞类型和特点接种密度培养条件常规传代传代时间对数生长期传代比例原瓶细胞分于2-4瓶贴壁细胞酶充分消化二.角质形成细胞培养问题**胶原为滋养层培养法4气—液交界面培养法5角质形成细胞培养方法1组织块培养法23T3细胞为滋养层培养法3无血清培养法6组织块培养法将表皮块贴附在培养瓶壁上,角质形成细胞逐渐从组织块边缘爬行长出。特点稳定可靠获得的细胞数量有限细胞生长周期长成纤维细胞污染3T3细胞滋养层培养法3T3细胞经丝裂霉素C或γ-射线预处理(失去分裂增殖功能)后,低密度接种在培养瓶壁上,再将角质形成细胞种植在此细胞滋养层上。3T3细胞小鼠胚胎瘤成纤维细胞株滋养层作用促使角质形成细胞的贴附和生长,并形成集落,最后融合成复层鳞状上皮接触性抑制成纤维细胞生长分泌促进角质形成细胞有丝分裂的活性因子。通过细胞间相互作用,调节与角质形成细胞增殖相关的生物因子。产生基质成分,促进角质形成细胞贴壁。3T3细胞促进角质形成细胞粘附和生长的途径:3T3细胞滋养层培养法特点细胞接种密度低、增殖速度快且细胞生长稳定。3T3细胞逐渐被挤压,随着角质形成细胞集落不断扩大形成冠状,然后被压缩成条索状,最后脱落且消失。3T3细胞培养过程中会分泌异种蛋白和抗原,用它作为滋养层培养的人角质形成细胞或人工表皮,移植后可能引起异种排斥反应。培养过程中角质形成细胞角化明显。改进法：向培养基中加入表皮生长因子、能增加细胞内cAMP水平的试剂（霍乱毒素等）。胶原滋养层培养法角质形成细胞的贴壁率玻璃培养瓶2.8%～7%,塑料培养瓶14%预铺胶原的塑料培养瓶70%～80%胶原促进角质形成细胞粘附、生长的机制01细胞外基质的主要成分,促进细胞贴壁。02覆盖培养瓶壁上不利于角质形成细胞粘附、03生长的化学基团。04为角质形成细胞提供粘附所需的特异性化学05基团。06为角质形成细胞的生长提供必要营养。07