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第十一章血清学试验第六节免疫标记技术免疫标记

技术是利用抗原抗体反应的特异性和标记分子极易检测的高度敏感性相结合形成的试

验技术。免疫标记技术主要有荧光抗体标记技术、酶标抗体技术和同位素标记抗体

技术。它们的敏感性和特异性大大超过常规血清学方法，现已广泛用于传染病的诊断、

病原微生物的鉴定、分子生物学中基因表达产物分析等领域。其中酶标抗体技术最

为简便，应用较广。这里主要介绍荧光抗体标记技术和酶标抗体技术。

一、荧光抗体标记技术

荧光抗体标记技术（fluorescent-labelledantibodytechnicque）是用荧光色素

标记在抗体或抗原上，与相应的抗原或抗体特异性结合，然后用荧光显微镜观察所

标记的荧光，以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。

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（一）原理荧光素在10的超低浓度时，仍可被专门的短波光源激发，在荧光

显微镜下可观察到荧光。荧光抗体标记技术就是将抗原抗体反应的特异性、荧光检测

的高敏性、以及显微镜技术的精确性三者结合的一种免疫检测技术。

（二）荧光色素荧光色素是能产生明显荧光，又能作为染料使用的有机化合物。

主要是以苯环为基础的芳香族化合物和一些杂环化合物。它们受到激发光（如紫外

光）照射后，可发射荧光。

可用于标记的荧光色素有异硫氰酸荧光黄（FITC）、四乙基罗丹明（RB200）

和四甲基异硫氰酸罗丹明（TMRITC。其中FITCM用最广，为黄色结晶，最大吸收

光波长为490495nm,最大发射光波长520530nm可呈现明亮的黄绿色荧光。FITC

〜〜

（

分子中含有异硫氰基，在碱性pH9.0〜9.5）条件下能与IgG分子的自由氨基结合，

形成FITC-IgG结合物，从而制成荧光抗体。

抗体经荧光色素标记后，不影响与抗原的结合能力和特异性。当荧光抗体与相

应的抗原结合时，就形成了带有荧光性的抗原抗体复合物，从而可在荧光显微镜下

检出抗原的存在。

（三）荧光抗体染色及荧光显微镜检查1．标本片的制备标本制作的要求首先

是保持抗原的完整性，并尽可能减少形态变化，抗原位置保持不变。同时还必须使

抗原标记抗体复合物易于接受激发光源，以便很好地观察和记录。这就要求标本要

相当薄，并要有适宜的固定处理方法。

根据被检样品的不同，采用不同的制备方法。细菌培养物、血液、脓汁、粪便、

尿沉渣及感染的动物组织等，可制成涂片或压印片。感染组织最好制成冰冻切片或

低温石蜡切片。也可用生长在盖玻片上的单层细胞培养作标本。

标本的固定有两个目的，一是防止被检材料从玻片上脱落，二是消除抑制抗原

抗体反应的因素。最常用的固定剂是丙酮和95%勺乙醇。固定后用PBS反复冲洗,干

后即可用于染色。

2．染色方法荧光抗体染色法有多种类型，常用的有直接法和间接法两种。

（1）直接法取待检抗原的标本片，滴加荧光抗体染色液于其上，置湿盒中，于

37C作用30min,用pH7.2的PBS®漂洗15min,冲去游离的染色液，干燥后滴加缓冲

甘油（分析纯甘油9份加PBS1份）封片，在荧光显微镜下观察。标本片中若有相应

抗原存在，即可与荧光抗体结合，在镜下见有荧光抗体围绕在受检的抗原周围，发

出黄绿色荧光（图11-8）。直接法应设以下对照，标本自发荧光对照，阳性标本和

阴性标本对照。该方法优点是简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性

偏低，而且每检一种抗原就需要制备一种荧光抗体。

（2）间接法取待检抗原的标本，首先滴加特异性抗体，置湿盒中，于37C作

（）

用30min,用pH7.2的PBS®漂洗后，再滴加荧光