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时间分辨荧光免疫分析技术的研究

进展及在食品安全领域中的应用

应化1001王旸慧

随着分析方法的飞速发展，无论是食品中有毒有害物质，还是环境中痕量元素的检测，或

者生物体内功能因子的分析，都迫切需要一种灵敏度高、快速准确、性能稳定的痕量分析方法。

时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolvedfluoroimmunoassay，简称为TRFIA）是20世

纪80年代中期发展起来的一种新的荧光标记技术。这种方法应用某些特殊的稀土金

属，能够区分背景光的散射所引起的干扰，从而大大地提高了分析的灵敏度。与传统的酶免疫

法（EIA）、发射免疫分析法（RIA）相比，它具有很多优点：灵敏度高达10-19；稳定

性好，克服了酶和放射性荧光物质的不稳定性；动态范围宽；试剂货架期

长；无放射性危害等,时间分辨荧光分析目前被公认为是灵敏度最高的分析方法之一。

一、时间分辨荧光免疫分析法的原理及优势

时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA）是在荧光分析（FIA）的基础上发展起来的一种特殊

的荧光分析法。它利用了具有独特荧光特性的镧系元素及其螯合物为示踪物，标记抗体、抗

原、激素、多肽、蛋白质、核酸探针及生物细胞，以代替传统的荧光物质、酶、同位

素、化学发光物质。用时间分辨荧光免疫分析检测仪测定反应产物中的荧光强度，根据产物荧

光强度和相对荧光强度的比值，准确地测定反应体系中被分析物的浓度。TRFIA所使用的荧光

标记物是镧系稀土金属，由于镧系稀土金属离子螯合物有很长的荧光寿命（微秒级），有别于

传统荧光的短荧光寿命，使其能通过时间分辨方式区别于背景荧光（钠秒级），正是由于荧光

衰变时间长，可以延缓测量时间，待测样品中短寿命的本底荧光衰变后再测稀土离子的特异荧

光，因此可完全消除本底荧光的干扰。镧系稀土金属离子螯合物荧光很宽的Stokes位移使其

容易通过波长分辨方式进一步区别于背景荧光，提高方法学的稳定性。镧系稀土金属离子螯合物

狭窄的荧光发射峰使其荧光检测具有很高的效率，进一步提高了信号检测的特异性和灵敏性。

此外，由于检测时加入了荧光增强液，它可使原来荧光增强100万倍，以上各种因素使

TRFIA的检测灵敏度和准确性大大提高。

二、TRFIA的反应模式

目前在实践中应用的主要有固相双位点夹心法和竞争法。夹心法多用于蛋白质类大分子化

合物的测定，竞争法多用于小分子半抗原的检测。反应模式流程如下：

1、双抗体夹心法（检测抗原）

ffff

—抗包被、封闭加入检测样品加入Eu3+标记的二抗加入增强液检测。

2、竞争法（检测抗体）

ffff

抗原包被、封闭加入一抗/检测样品加入Eu3+标记的二抗加入增强液检测。

三、传统TRFIA的改进

1、酶放大的时间分辨荧光免疫分析法

Papanastsiou-Diamandi等报道这种分析技术，其原理与常规方法完全不同。本方法以碱

性磷酸酶催化底物5-氟水杨酸磷酸酯（FSA），FSA与稀土离子Tb3+作用生成FSA－

Tb3+-EDTA三元复合物。结合后的Tb3+在紫外光激发下可发出很强的荧光信号。不

加增强液即可在时间分辨荧光仪上测量Tb3+的特征荧光。近年，我国赵启仁等也利

用酶放大的时间分辨荧光分析法进行核酸杂交和碱性磷酸酶的测定，灵敏度达到10pg。

2、链霉亲和素-生物素（SA-biotion）系统的时间分辨荧光免疫分析法

由于链霉亲和素（SA）不带糖基、等电点低，在检测中具有比亲和素（AV）低的背景而大大提

高了检测的灵敏性。SA-biotin系统可偶联抗原、抗体、报告酶、寡核苷酸分子以及PE