[管理]胞内游离Ca的测定方法.pdfVIP

PluronicF-127(F127)美国MolecularProbesInc.产品。

Ultima型共聚焦激光扫描显微镜为美国MERIDIANInstrumentsInc产品。

1.光源：Ultima型50MwUV,200MwVisible

2.激发波长：351-364nm，488nm，514nm

3.扫描系统：Ultima为台阶扫描，精度0.1um

目的：监测细胞胞浆中游离钙的动态变化

原理：正常细胞内游离钙浓度[Ca2┼]i为0.1umol/L,胞外钙离子浓度为

1.2-1.3mmol/L,相差达10000倍。胞外钙内流和胞内钙库动员形成的钙震荡(钙

峰或钙波)在各种生理过程中起重要作用；病理状态下细胞内钙超负荷将造成一

系列代谢紊乱,直至细胞坏死或凋亡；钙离子通道阻断剂已广泛应用于临床。显

而易见,测定[Ca2┼]i在生理学、病理学和药理学等研究工作中均具有重要意义。

Fluo-3/AM等钙离子荧光染料以脂溶性的乙酰甲氧基酯（AM酯）的形式导入细

胞，在胞内水解酶的的作用下水解成游离酸，与钙离子的结合物在激发光作用下

能产生特异的荧光。荧光信号的强弱随钙离子浓度的变化而变化。

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100ugFluo-3/AM溶于100ulDMSO中，就是1ug/ul,1mg/ml,1g/L

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方法：1.预先用二甲基亚砜(DMSO)将Fluo-3/AM配制为1mmol/L(1g/L)原

液,-20oC避光保存。F127用DMSO配制成20%溶液(W/V)。用无血清无酚红培

养液将Fluo-3/AM稀释成终浓度为10umol/L，并加入0.1％的PluronicF-127备

用。2.移去培养皿中的原培养液，用PBS液冲洗心肌细胞2遍，加入10umol/L

染料液1ml，置于37oC的CO2孵箱里避光温育30min。

3.将染色后的心肌细胞用PBS液冲洗3遍，加入1mlDMEM液后置于20倍光学

显微镜观察区域及层面，用LSCM观察Fluo-3染色的细胞的某一层面的荧光图

像。

4.启动LSCM，选择488nm氩离子激光，启动计算机，运行lasersharp2000软

件，选择time-course程序，设置扫描间隔时间（30sec）、扫描次数（300次），

开始扫描。

5.将数据输入excel进行整理、统计、分析。

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一、细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+])的测定

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