TCID50的测定方法_原创精品文档.pdfVIP

实验病毒感染力的滴定（TCID的测定）

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滴度：在半定量或定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即

为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱。滴度（抗体的多少）越高，受传染的机会

就越小。

一、实验目的

了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID的操作

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步骤、计算方法及含义。

二、测定病毒感染力的方法

半数致死量LD50(50%lethaldose)：用动物或鸡胚来检测

半数鸡胚感染量EID50(egg50%infectivedose)：用鸡胚来检测

半数细胞培养物感染量TCID50（50%tissuecultureinfectivedose)：用细胞来检测

蚀斑形成单位（plaqueformingunit，PFU）：用细胞来检测

三、材料

1、长满单层的细胞1瓶

2、胰酶、吸球、吸管、生长液

3、96孔细胞培养板

4、加样器、枪头

5、病毒液（PRV）

TCID50的操作步骤

1)准备细胞

取出一块细胞培养板，每个孔大约传8000～10000个细胞（一个T25瓶的细

胞消化后加10ml培养液正好传一块96孔板，要传匀）。每个孔的细胞铺成单层大约60％

丰度即可接种病毒（下午传好板第二天早上就能用）。

细胞对照选取16个孔即可。滴定与对照可以在一块培养板上进行，操作中注意不要窜

孔。也可以分别在不同的细胞培养板上进行，但要保证实验条件一致。

(2)稀释待测病毒液。

A法为参考书上标准的操作方法

B法参照书将液体量减少后的结果

病毒稀释液根据是否需要胰酶来选择适合的液体，无论哪种都无血清。

A向每支试管中加入1.8ml病毒稀释液。向1号试管中加入0.2ml病毒，依次10倍系列

稀释至适宜浓度，最后一支试管。

B在EP管中用无血清的孵育液10倍倍比稀释病毒原液(10-1，10-2…10-10等)，根据病

毒大致的滴度确定稀释的倍数。首次滴定可以多稀释几个滴度。

根据接种的孔数稀释病毒，常规每个稀释度接种4孔，则每个稀释度配500µl，即10-1

为50µl加入450µl的孵育液中；如每个稀释度接种8个孔，则各配制1ml，即10-1为

100µl加入900µl孵育液中。若接种8个孔，则相应增加液体量。上述的配液并不是固

定不变的，可以根据接种的量自行调整。

【！此步操作注意事项：

1）建议每个稀释度接种8个孔，若要统计分析则还要增加至16个孔。

2）病毒稀释过程中一定将病毒液与孵育液充分混匀。

2）此过程中需要使用加样器和tip头。使用前用75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射

20min，确保无菌。使用新高压的tip头，外包装一定在超净台（或安全柜中打开）。】

(3)接种

取细胞培养板，用多道加样器（又称排枪）吸去96孔板中的培养液，吸取孵育液加在

每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因为血清能干扰病毒

的吸附）。将稀释好的病毒液加到96孔板上，每孔100µl，根据观察的习惯，一般从右

到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度（10-1，10-2）到原液加样。【切记：设置正

常的细胞对照。每次实验要重复4次，计算标准差。】

37℃CO2培养箱中孵育1h，取出培养板吸去病毒液（从低浓度向高浓度吸取可避免窜

孔），加入维持液200µl继续在CO2培养箱中培养。

(4)培养

将培养板放置于CO2培养箱。培养温度37℃，培养5-7天。

(5)测定结果

取出培养板，显微镜下观察细胞病变。

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1、在离心管中用MEM将病毒液作连续10倍的稀释，从10-10。

2、将稀释好的病毒接种到96孔培养板中，每一稀释度接种一纵排，共8孔，每孔接种

100µl。