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实时荧光定量PCR：

实时荧光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR）是一种在

DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）

循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定

DNA序列进行定量分析的方法。·

Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR

进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该

模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。

原理：

所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光

基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲

线对未知模板进行定量分析的方法。

检测方法

1.SYBRGreenⅠ法：

在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料

特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR

染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR

产物的增加完全同步。

SYBR定量PCR扩增荧光曲线图

PCR产物熔解曲线图（单一峰图表明PCR扩增产物的单一性）

2.TaqMan探针法：

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR

扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光

基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即

每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累

积与PCR产物的形成完全同步。

服务流程

1.客户认真写好订单，提供待检基因相关信息；

2.签订技术服务合同，支付预付款（30-50%)；

3.设计合成定量PCR引物（或客户提供文献引物委托本公司合

成）；

4.DNA/RNA的抽提、定量、RNA反转录；

5.PCR预实验，主要检测引物的特异性和扩增效率；

6.正式定量实验：对所有样品上机检测；

7.实验结果和数据分析，形成报告。

收费标准

优惠包干价：120元/样/基因（SYBRgreenI法，相对定量）

（含RNA提取，反转录，引物合成费用，上机测试费用（3个

重复）；一个内参免费（内参3个重复）

技术原理

将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温

变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与

模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系

中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的

基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧

光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对

照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

Ct值

Ct值（Cyclethreshold，循环阈值）的含义为：每个反应管内

的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。

1.荧光阈值（threshold）的设定

PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈

值的缺省（默认）设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10

倍，即：threshold=10*SDcycle3-15

2.Ct值与起始模板的关系

每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，

公式如下。

Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)

n为扩增反应的循环次数，X0为初始模板量，Ex为扩增效率，

N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。

起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可

作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。

因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品

的起始拷贝数。

荧光化学物质