土壤酶活性测定.pdfVIP

土壤与环境微生物研究法／李振高，骆永明，滕应编著．一北京：科学出版社，2008

过氧化氢酶（398-399）脲酶（404-405）磷酸酶（412-413）

关松荫/土壤酶及其研究法农业出版社1986年七月第一版蔗糖酶274-276

土壤脲酶（urease）活性的测定方法：靛酚比色法

（一）方法原理

土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质，酶促水解生成的氨与酚类化合物起反应生成蓝

色的靛酚，颜色深度与氨含量相关，因而用于脲酶活性的测定。

（二）试剂

1）甲苯

2）10%尿素：称取10g尿素，加蒸馏水90ml。

3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：取184g柠檬酸溶于300ml蒸馏水中，另取147.5gKOH

溶于蒸馏水，再将二种溶液合并，用1NNaOH将pH调节至6.7，用水稀释至1L。

4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：

62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A

液），存于冰箱中；

27克NaOH溶于100毫升水（B液）,存于冰箱中。

将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将两种溶液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。

5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。

6）氮的标准溶液：精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000mL，得到1mL含有0.1mg

氮的标准液（100ppm）。

（三）测定步骤

（1）标准曲线绘制

吸取配置好的氮溶液10mL，定容至100mL，即为10ppm，吸取0、1、2、3、4、5、10、

15、20mL移至50mL容量瓶，加水至20mL，再加入4mL苯酚钠，仔细混合，加入3mL次

氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。即为0、0.2ppm、0.4ppm、0.6ppm、0.8ppm、

1ppm、2ppm、3ppm、4ppm的标准曲线。将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色

测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。

（2）土壤中脲酶活性的测定

称取10g土壤置于100ml容量瓶中。用2mL甲苯处理15分钟。往瓶中加入10mL10%

尿素溶液和20mL柠檬酸缓冲液（pH6.7）。仔细混合后，将瓶放在37℃恒温箱中，放置24h。

之后用38℃水定容至100ml（甲苯浮在刻度线上）。与此同时，进行以水代替基质（10ml10%

尿素用10ml蒸馏水代替），及无土对照测定。

培养结束后，将悬液过滤。吸取3mL（视情况而定）滤液于50mL容量瓶中，用蒸馏水

加至10mL。然后按标准曲线绘制的操作加入苯酚钠等试剂，显色，比色，最后根据标准曲线

求出氨态氮含量。

以每克土壤在37℃下24h内酶解尿素释放的NH-N的毫克数来表示脲酶活性。

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二.过氧化氢酶测定(容量法)

1.试剂配制

a.0.3％过氧化氢溶液：将10ml30%的过氧化氢用水稀释至1L，此溶液不稳定，需临时

配置。

b.1.5mol/L硫酸：8.4ml浓硫酸溶于水，再用蒸馏水稀释至100ml

c.0.002NKMnO4溶液：称取化学纯高锰酸钾0.3161g，溶于1升蒸馏水中，贮于棕色

瓶中，备用。如果知道酶活性很高的话可以适当变化高锰酸钾浓度

2.操作步骤

（1）取5g过1mm风干土，置于150mL三角瓶中，并注入40mL蒸馏水和5mL0.3％HO

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溶液。

（2）同时设置对照，即三角瓶中注入40mL蒸馏水和5mL0.3％过氧化氢溶液，而不加土

样。并作无土对照。

（3）将三角瓶放在振荡机上振荡（120r/min）30min后，加入5mL1.5mol/L硫酸，以稳