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实验九
酶联免疫吸附试验
(Enzyme?Linked?Immunosorbant?Assay，ELISA);1、掌握抗原和抗体的制备方法
2、掌握酶联免疫分析抗体效价的方法;实验原理;ELISA的基本原理有三条;ELISA的特点与方法
;1、动物免疫实验?
按1∶1的比例混匀褐腐病菌抗原与福氏完全佐剂并乳化完全后，以1.0mg/kg剂量多点肌肉注射进行初次免疫；分别间隔2周，按1∶1的体积比混匀抗原与福氏不完全佐剂并乳化完全后，1/2剂量进行第2、3次免疫；然后再分别于第8、11、13周，按1∶1的体积比混匀抗原与福氏不完全佐剂并乳化完全后，以1.0mg/kg剂量加强免疫。;2、鸡卵黄抗体的提取?
使用卵黄分离器分离卵黄，去除卵清蛋白和卵黄膜，收集卵黄，加6倍于卵黄体积的蒸馏水，用0.1M盐酸调pH至5.0，搅匀后4℃放置过夜，4℃10000r/min离心25min，取上清液待测。
3、鸡卵黄抗体（IgY）的效价检测?
以沙门氏菌抗原为包被抗原，1%BSA作封闭剂，待测鸡卵黄抗体IgY为第一抗体，辣根过氧化物酶标记兔抗鸡IgG为第二抗体，TMB为底物（OD）。OD450/630nm值大于阴性对照平均值2.1倍的最高稀释度为其抗体效价。;实验器材：
酶标板，恒温箱，酶标仪。
实验试剂：
沙门氏菌抗原，包被液，封闭液，结合物稀释液，底物缓冲液，洗涤液，底物工作液，终止液，待测一抗，HRP标记兔抗鸡二抗。;操作步骤：
①特异性抗原包被于酶标版（固相载体），4℃过夜，洗涤3次。加100μl封闭液，37℃温育1h。
②加100μl待检标本，经过温育1h使相应抗体与固相抗原结合，洗涤3次，除去无关的物质。
③加100μl酶标二抗，与已结合在固相抗体上的抗原反应，37℃温育1h。洗涤，除去未结合的酶标抗体。
④加底物显色20min，加50μl终止液终止反应，用酶标仪测量光密度值450/630nm，计算抗体效价。;10;思考题：
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