DB41T 706-2011 猪传染性胃肠炎病毒与流行性腹泻病毒二重RT-PCR鉴别诊断试验方法.docxVIP

DB41

河南省地方标准

DB41/T706—2011

猪传染性胃肠炎病毒与流行性腹泻病毒二重RT-PCR鉴别诊断试验方法

2011-12-20发布

2011-12-20实施

河南省质量技术监督局发布

DB41/T706—2011

I

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由河南省畜牧局提出并归口。

本标准起草单位：河南省动物疫病预防控制中心。

本标准起草人：吴志明、张志凌、闫若潜、赵明军、谢彩华、赵雪丽、刘梅芬。

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猪传染性胃肠炎病毒与流行性腹泻病毒二重RT-PCR鉴别诊断试验方法

1范围

本标准规定了猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二重RT-PCR试验的样品采集、处理、存放及运输、操作方法及结果判定。

本标准适用于对疑似感染猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒的猪肠组织、胃肠道粘膜、肠内容物或粪便等样品中病毒核酸进行检测。

2术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。2.1

二重反转录聚合酶链式反应(二重RT-PCR)

二重RT-PCR是在同一反转录体系内加入两条分别针对二种病毒相应基因序列的反转录引物进行反转录，在同一PCR反应混合液中加入两对分别针对二种病毒相应基因序列的特异性引物进行PCR扩增，通过一次PCR反应，可同时扩增出二种病毒相应核酸片段的RT-PCR反应。

3试剂和仪器设备

3.1试剂

3.1.1除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯。提取RNA所用试剂均应使用无RNA酶的容器进行分装。

3.1.2组织悬液、粪便及肛门拭子悬液（见附录A）常温保存。

3.1.3裂解液（TriZol）、氯仿，1×核酸电泳缓冲液、0.01mol·L-1（pH7.2）的PBS、焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水（见附录A）2℃~8℃保存。

3.1.4异丙醇，75%乙醇、DNA分子量标准、6×电泳上样缓冲液均－15℃以下保存。

3.1.5阳性对照样品、阴性对照样品见附录A。

3.1.6RT-PCR扩增用上、下游引物序列参见附录B。

3.1.7猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二重RT-PCR反应混合液组成、说明及使用注意事项参见附录C。

3.2仪器设备

PCR扩增仪，高速冷冻离心机（离心力应在12000×g以上），电泳仪和水平电泳槽，恒温水浴锅，

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2℃~8℃冰箱，－20℃冰箱，单道微量移液器（0.5μL～10μL；2μL～20μL；20μL～200μL；100μL~1000μL），组织匀浆器或研钵，凝胶成像系统(或紫外透射仪)。

4样品的采集、处理、存放及运输

4.1样品的采集及处理

4.1.1组织样品

用无菌的剪刀剪取猪小肠组织0.5g于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨，或用刀片刮取病死猪胃肠道粘膜放入无菌1.5mL离心管中，加0.3mL～0.5mL组织悬液混匀，将组织悬液转入无菌1.5mL离心管中，4℃条件下5000r·min-1离心10min，取上清转入新的无菌1.5mL离心管中，编号备用。

4.1.2肠内容物样品

无菌取小肠内容物样品3g，置于无菌离心管中，加0.5mL～1.0mL肠内容物悬液混匀，4℃条件

下5000r·min-1离心10min，取上清转入新的无菌1.5mL离心管中，编号备用。

4.1.3肛门拭子样品

将棉拭子深入猪肛门内2cm～3cm轻轻旋转3～5圈，放入盛有1.0mL拭子悬液的1.5mL离心管中，然后将拭子悬液转入无菌1.5mL离心管中，4℃条件下5000r·min-1离心10min，取上清转入新的无菌1.5mL离心管中，编号备用。

4.2存放与运送

采集或处理的样品在2℃~8℃条件下保存应不超过24h，密封后，冷藏保存，及时运送到实验室。若需长期保存，应放置于－40℃以下处冷冻保存，应避免反复冻融。

5操作方法

5.1样品RNA的制备

5.1.1取1.5mL灭菌离心管，每管加入300μL裂解液，分别加入待测样品、阴性对照样品、阳性对照样品各100μL，吸头反复吸打混匀（一份样品换用一个吸头）；再加入100μL氯仿，充分颠倒混匀

（不宜过于强烈）；于4℃条件下，12000r·min-1离心15min。

5.1.2吸取离心后各管中的上清液150μL转移至新的1.5mL灭菌离心管中（不要吸出中间层），加入150μL－