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酶催化蔗糖转化反应

院系：化学学院

年级：2011级

一、目的和要求

1．用旋光仪对酶催化蔗糖转化反应进行测定。

2．了解掌握蔗糖酶的制备和酶活力的测定。

3．学会米氏常数的测定。

二、实验原理

蔗糖转化反应

蔗糖＋水——→葡萄糖＋果糖

+

这个反应在H或蔗糖酶的催化下可以很快的进行。蔗糖及其转化产物都有不

对称的碳原子，它们都有旋光性，但是它们的旋光能力不同，所以可以利用体系

在反应过程中旋光度的变化来描述反应进程。

溶液的旋光度与溶液中所含旋光物质的旋光能力、溶剂的性质、溶液的浓度、

测量样品管的长度等均有关系。当其他条件不变时，旋光度与反应物浓度C成

线形关系，即

＝kC

作为反应物的蔗糖是右旋性物质，其比旋光度为66.6；生成物的葡萄糖也是

右旋性的物质，其比旋光度为52.5，但是果糖是左旋性物质，其比旋光度为－

91.9。由于生成物中果糖左旋性比葡萄糖右旋性大，所以生成物呈现左旋性质。

因此，随着反应的进行，体系的右旋角不断减小，反应到某一时刻，体系的旋光

度可恰好等于零，而后就变成左旋，直到蔗糖完全转化，这时体系的左旋角达到

最大值。

三、仪器和试剂

旋光仪1台

恒温槽1套

葡萄糖、果糖、蔗糖（均为分析纯）

醋酸－醋酸钠缓冲溶液

四、实验步骤

1．蔗糖酶的提取

取鲜酵母20g于100mL三角瓶中，加入1.6gNaAc，搅拌15～20分钟后

使团块液化，再加3mL甲苯，混和后摇动10分钟，放在恒温箱中37℃保温24

小时左右。取出后加入3.2mL4M醋酸和100mL水使pH值在4.5左右。将混

合物以每分钟3000转的速度离心30分钟，离心后形成三层，取中层黄色液体，

再以同样速度离心30分钟，所得澄清的黄色液体即为蔗糖酶粗品。将此蔗糖酶

用pH＝4.6的缓冲溶液稀释10倍，过滤后冷冻保存。

2．蔗糖转化体系旋光度和浓度的工作曲线

根据蔗糖转化体系的蔗糖和果糖、葡萄糖的比例关系，可以制作不同浓度下

混和体系的旋光度的工作曲线。例如0.1M蔗糖转化体系的旋光度和葡萄糖浓度

的工作曲线，实际上是制作0.1M蔗糖转化进程工作曲线，不同的蔗糖浓度有不

同的进程工作曲线，从若干不同蔗糖浓度的进程工作曲线得到这些工作曲线直线

关系很好，且直线的斜率与蔗糖的浓度无关，经过线性拟合，其直线方程为：

y＝－60.28x＋

其中x－蔗糖转化成葡萄糖的浓度（M）

y－蔗糖转化进程中体系的旋光度值

－不同浓度蔗糖溶液的旋光度值，其值可以测定，也可以通过下式计

算。

＝66.6×L×C（L＝10cm，C是蔗糖浓度g/mL）

通过上述的直线方程，可以测定任何浓度蔗糖转化体系的旋光度值，求出其

转化成葡萄糖的浓度x，从而可以求得不同反应时间的葡萄糖浓度。

3．酶比活性的测定

配制2.5％的蔗糖溶液100mL，测定其旋光度。在21.3℃的条件下加入蔗糖

酶5mL，反应3分钟测定体系旋光度值y，用公式y＝－60.28x＋求出葡萄

糖浓度x，及生成葡萄糖的毫克数，即可求出酶的比活性。（上述方法制备的酶，

其活性约每毫升20单位。）

比活性(单位/mL)＝(生成葡萄糖的毫克数)/(酶的体积)

4．蔗糖酶进程曲线的制作

取200mL0.1M的蔗糖溶液，在35℃水浴条件下恒温，加10mL蔗糖酶溶

液，每5分钟取出20mL反应液加5滴5MNaOH灭活后，测定一次体系的旋光

度。求出葡萄糖的浓度，用葡萄糖的浓度对时间作图，得到蔗糖酶催化反应的进

程曲线。

5．蔗糖酶米氏常数的测定

用缓冲溶液稀释0.5M的蔗糖溶液成为一系列不同浓度的蔗糖溶液各50mL，

在35℃恒温条件下加入10mL已知活性的蔗