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水产品中羟脯氨酸含量的测定高效液相色谱法

1范围

本标准规定了水产品中羟脯氨酸的高效液相色谱测定方法。

本标准适用于水产品中羟脯氨酸含量的测定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3原理

用盐酸于110℃水解试样，稀释、过滤水解产物，羟脯氨酸经DABS-Cl衍生后，用C18柱分离，高效液相色谱紫外检测器检测，外标法定量。

4试剂

4.1除另有规定外，所有试剂均为分析纯。

4.2试剂主要包括：

——实验用水：应符合GB/T6682中一级水标准；

——乙腈：色谱纯；

——盐酸；

——无水乙醇；

——N，N-二甲基甲酰胺；

——碳酸氢钠；

——氢氧化钠；

——柠檬酸：优级纯；

——磷酸二氢钠；

——二甲基氨基偶氮苯磺酰氯：DABS-Cl（4-Dimethylaminoazobenzene-4-sulfonylchloride），纯度≥98﹪;

——羟脯氨酸标准品：L-羟脯氨酸（L-Hyp），纯度≥99﹪;

——羟脯氨酸标准储备溶液：准确称取羟脯氨酸标准品0.1000g，用水溶解并定容至100mL。此溶液浓度为1.00g/L。4℃避光保存，有效期1个月；

——羟脯氨酸标准中间溶液：移取羟脯氨酸标准储备溶液，用水逐级稀释至1.0mg/L。临用时配制；——0.1mol/L碳酸氢钠溶液：称取碳酸氢钠8.4g，用水溶解并稀释至1L；

——2mol/L氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠80g，用水溶解并稀释至1L；

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——0.1mol/L柠檬酸溶液：称取柠檬酸21.0g，用900mL水溶解，加2mol/L氢氧化钠溶液70mL，用2mol/L氢氧化钠溶液滴定至pH6.4，用水定容至1L；

——12mmol/L柠檬酸溶液：量取0.1mol/L柠檬酸溶液120mL，加N，N-二甲基甲酰胺40mL，用水稀释至1L；

——衍生试剂溶液：称取DABS-Cl0.013g，用乙腈溶解并定容至10mL，4℃避光保存，有效期1个月；

——衍生反应终止液：配制50mmol/L磷酸二氢钠溶液，用2mol/L氢氧化钠溶液调至pH7.0，再加等体积无水乙醇；

——6mol/L盐酸溶液：取盐酸50mL，加水稀释并定容至100mL。

5仪器与设备

主要包括：

——高效液相色谱仪：配紫外检测器；

——天平：感量0.01g；

——电子天平：感量0.0001g；

——匀浆机；

——电热恒温干燥箱；

——恒温水浴；

——真空泵；

——酒精喷灯；

——微孔滤膜：0.45μm；

——涡旋混合器。

6试样制备

鱼，去鳞、去皮，沿脊背取肌肉，将肌肉、鳞、皮单独收集；虾，去头、去壳、去肠线，取肌肉部分；蟹、贝、甲鱼、海参、海带等取可食部分，样品充分搅碎、混匀。如不能及时检测，-18℃以下冷冻保存备用。

7测定步骤

7.1水解

称取适量匀浆后的样品于水解管中，使每管中含蛋白质约20mg，加入6mol/L盐酸6mL，充氮气1min，抽真空至管内盐酸起泡，用火焰将管封口。于110℃水解22h，冷却后，将水解液全部转移到50mL容量瓶中，加水至刻度。混匀后，根据样品中羟脯氨酸含量不同，分别取1mL～5mL水解液于10mL容量瓶中，加2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.5～7.5，加水稀释至刻度。取1mL稀释液用0.45μm滤膜过滤备用。

7.2衍生

取过滤后的稀释液30μL于1.5mL具塞离心管中，加0.1mol/L碳酸氢钠溶液30μL，衍生试剂溶液60μL，漩涡混匀30s，70℃水浴中衍生反应，2min时取出漩涡混匀1次，继续于70℃水浴中反应13min，反应结束后取出迅速冷却，加入衍生反应终止液630μL，用0.45μm滤膜过滤，供高效液相色谱分析。

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7.3测定

7.3.1色谱条件

主要包括以下几项：

a)色谱柱：MG-C18柱，250mm×4.6mm（内径），粒度5μm，或与之性能相当者；

b)流动相：A：12mmol/L柠檬酸溶液（4.17）；B：30%A＋70%乙腈（含4%N，N-二甲基甲酰胺）；

梯度洗脱程序见表1；

c)流速：1.4mL/min；

d)柱温：35℃;

e)进样量：20μL；

f)检测波长：436nm。

表1梯度洗脱程序

时间/min

流动相A/﹪

流动相B/﹪