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第八章PCR技术原理

PCR：polymerasechainreaction，聚合酶链式反应。

基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制

聚合酶链反应：一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方

法。

PCR技术：是通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特

殊区域扩增出来的技术。

过程与复制DNA复制一样：

模板变形，引物与模板复性，延伸。

第一节PCR的基本原理和工作方式

一、PCR的基本原理

1．基本要素

A.基本要素与DNA复制的基本要素是一致的。待拷贝的DNA称为模板，

它可以是双链DNA也可是单链DNA，最后扩增得到的产物是双链状态的。

B.引物是DNA复制的先锋，就象结晶过程中的晶核，引导DNA的合成。

在PCR扩增中一般使用合成的寡核苷酸作引物。

C.DNA聚合酶是DNA复制的动力，在dNTP等底物存在时在引物的引

导下沿着模板DNA合成互补的DNA链。

2．扩增原理

PCR技术的基本原理类似于天然DNA复制过程，其特异性依赖于靶序列两

端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成。

3．PCR扩增的步骤

1、模板DNA变性（denature）:模板DNA置于92℃-96℃，进行变性

（denaturation）处理，使dsDNA在高温下解链成为ssDNA，且热变性

不改变其化学性质；

2、模板DNA与引物的退火（annealing）（复性）：模板DNA经加热变性

成单链后，温度降至37℃-72℃（55℃），引物与模板DNA单链的互补

区相结合；

3、引物的延伸（extension）DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，

以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，连

续加到引物的3‘-OH端，合成一条与模板DNA链互补的半保留复制链。

这三个热反应过程的重复称为一个循环，经过20-40个循环可扩增到大量位于

两条引物之间序列的DNA片段。

PCR技术的特点：

1）高度的灵敏性

2）特异性

引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。

引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非

特异性扩增。

二、PCR反应体系

缓冲液，脱氧三磷酸核苷（dNTPs）、特异性引物、模板DNA、耐热DNA聚

合酶

1．缓冲液

标准的缓冲液含10mMTrisHCl·，pH为8.3-9.0（室温），而在延伸温度

（72℃）下，pH值接近7.2。

缓冲液中含有一种二价阳离子，用于激活DNA聚合酶的活性中心，一般使用

Mg2+，（一般以MgCl2的形式提供，标准浓度为1.5mM。）有时使用

Mn2+。

Mg2+浓度的高低会影响扩增的特异性和产率

2．脱氧核苷三磷酸（dNTP）

脱氧核苷三磷酸是DNA合成的底物，标准的PCR反应体系中含有等摩尔浓

度的4种dNTP，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP，终浓度一般为0.2mM

（即饱和浓度）。

dNTP的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。

3．引物

引物设计一般要考虑以下几个问题：

①位置

与待扩增的模板DNA