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人乳头状瘤病毒（HPV）实时荧光定量PCR培训大纲

一、实时荧光定量PCR技术

所谓实时定量PCR是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测

定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量。实时荧光定量PCR技术于1996年由美

国AppliedBiosystems公司推出。与常规PCR相比，它具有特异性更强，有效解决PCR产

物污染、自动化程度高，同时能对起始模板进行准确定量等特点。该技术借助于荧光信号来

检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，

建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意

义上的DNA定量。这是DNA定量技术的一次飞跃。

1、实时荧光定量PCR的原理

实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时

监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR

反应是在常规PCR的一对引物之外，加入一个两端带有荧光标记的寡核苷酸探针。在探针完

好的状态下，5′端报告荧光基团的激发光被3′端的淬灭荧光基团所抑制。PCR反应过程中，

随着链的延伸，Taq酶沿着DNA模板移动到荧光标记探针的结合位置，发挥它的5′→3′外

切核酸酶活性，将荧光探针切断，释放出报告荧光基团的荧光信号，每合成一个模板，一个

报告基团的信号释放，被释放的激离报告荧光基团的数目和PCR产物是一对一的关系。通过

定量PCR仪定时动态监测每一循环，可以得到样品实际扩增曲线，找到PCR扩增的对数期。

软件通过标准品的待测品的对数期比较，得到每一样品模板DNA的起始拷贝数。

1.1在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念——Ct值。C代表Cycle，t代表

threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循

环数（如图1所示）。

图1.Ct值的确定

1.2.荧光域值（threshold）的设定

PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个

循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10´SD

cycle6-15

1.3.Ct值与起始模板的关系

研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始

拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标

代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值（如图2所示）。因此，只要获得未知样品

的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

图2.荧光定量标准曲线

1.4.荧光化学

荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料〔2〕。现将其原理

简述如下：

1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探

针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，

报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性

将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧

光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR

产物形成完全同步。如图3所示。

图3.TaqMan荧光探针工作原理

2）SYBR荧光染料：

在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，

发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光

信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

2.实时荧光定量PCR的特点：

2.1特异性FQ-PCR具有引物和探针的双重特异性，故与传统的PCR相比，特异性大为提高。

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2.2敏感性FQ-PCR的敏感度通常达