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实验七-流式细胞仪检测技术

实验七流式细胞仪检测技术

免疫细胞是一组不均一的细胞群体。各种特定的细胞群其细胞表

面表达有各自特异的表面标志分子，利用这些特异的表面标志，可以

鉴定、分离和纯化相应的细胞群。随着单克隆抗体技术的诞生和免疫

标记技术（特别是荧光标记技术）的发展，以及计算机科学的应用，

使利用仪器的方法检测特异的细胞膜表面分子成为可能。本章介绍的

荧光激活细胞分类技术就是采用单克隆抗体技术和免疫荧光标记技术，

并结合光学检测和计算机分析技术而产生的鉴定和分离特定细胞亚群

的技术。

实验原理

流式细胞仪（flowcytometer）是一种能够探测和计数以单细胞

液体流形式穿过激光束的细胞检测装置，由于在检测中使用的细胞标

志示踪物质为荧光标记物，因此，用来分离、鉴定细胞的流式细胞仪

有被称为荧光激活细胞分类仪（fluorescenceactivatedcell

sorter,FACS）,是分离和鉴定细胞群及亚群的一种强而有力的应用工具。

其原理是在一组混合的细胞群中，加入特异的针对特定靶细胞表面分

子的荧光标记单克隆抗体，这种特异单克隆抗体与其对应的抗原靶分

子结合，结合后的荧光标记抗体停留在特定细胞的表面，称为荧光抗

体标记的靶细胞；将含有被标记细胞的混合细胞群混悬在一定容积的

上样缓冲液中，再通过FACS的进样吸管孔，仪器就会将细胞悬液制成

以单细胞排列的微细流束。当每一个细胞通过仪器的激光束照射时，

带在细胞上的荧光就会被相应的激光束激活并发出对应的荧光，通过

敏感的光电倍增管即可检测到从细胞表面发出的荧光。根据测得的散

射光（scatteredlight）可得到细胞大小及颗粒状态的信息；而从荧

光的发射强度(fluorescenceemissions)则提供了结合在细胞上的抗体

信息，进而也被反映了该细胞表面相应分子的表达情况。

在流式细胞仪分离装置中，返回到计算机的信号，可用来产生一

种电荷，这种电荷以特定准确的时间通过FACS的吸管孔，在与吸管孔

的液体流相相遇时，可将液体流打碎成只含一个细胞的微滴。含有电

荷的微滴就会从主液体流中偏移，穿过一双极板。带正电荷的微滴被

吸引至阴极，而带负电荷的被吸引至阳极。以这种方式，特定的细胞

亚群由于标记着不同的荧光抗体而带有不同的电荷，从而将目的细胞

从混合的细胞群中分拣出来。

实验应用

流式细胞仪主要有两个最基本的用途：第一是可以定量分析鉴定

活细胞表面表达的特异

分子，第二是进行特定的活细胞群的分离和纯化。

1.免疫细胞群的分类静止淋巴细胞之间从其外观形态难以区分，

都是以致密的核及少量细胞质组成的小而圆的细胞为特征。然而，这

些细胞确是由功能各异的不同细胞亚群所组成，各种细胞群表达各自

特殊的表面分子。例如,B淋巴细胞上表达有特异的膜表面免疫球蛋白

（mIg），而成熟的T淋巴细胞表面表达特异的CD3分子。T淋巴细

胞又可进一步按其表达的不同表面标志细分成不同的亚群，如

CD4+CD8-和CD4-CD8+亚群。因此，可由这些特征性的表面标志，

将细胞分为不同的群或亚群。

2.免疫细胞的分化发育免疫细胞分化发育的不同阶段，其表面标

志也在不断地发生着变化。如胸腺细胞（发育过程中的T淋巴细胞），

在发育的不同阶段从不成熟到成熟，其表面标志经历了从双阴性

（CD4-CD8-）到双阳性（CD4-CD8-），直到单阳性（CD4+CD8-

或CD4-CD8+）的过程。正常生理状态下，发育不同阶段的胸腺细胞

以一定的比例存在于胸腺中。通过检测这些标志，即可判定某些因素

（基因突变等）对胸腺细胞发育的影响。

3.免疫细胞的分子表达免疫细胞的不同因素的影响下，其表达的

分子也会发生变化。通过检测这些分子的变化，可分析细胞功能以及

细胞分化状态等。例如，静止的T淋巴细胞不表达或低水平表达CD69

分子；而一经活化，其表达CD69分子数量明显增加。因此，可通过

检测这些活化标志的变化来判定细胞状态以及研究影响细胞活化状态

的因素。

4.免疫细