聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳法分离血清蛋白质..pdfVIP

实验七聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳法分离血清蛋白质

一实验目的

掌握聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳法分离血清蛋白质。

二实验原理

聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰化胺凝胶作支持物的一种区带电泳，由于

此种凝胶具有分子筛的性质，所以本法对样品的分离作用，不全决定于样品各组

分所带净电荷的多少，即在电泳开始阶段，由于不连续pH梯度的作用，将样品

压缩成一条狭窄区带，从而提高了分离效果。

聚丙烯酰胺凝胶具有网状立体结构，很少带有离子的侧基，惰性好，电泳时，

电渗作用小，几乎无吸附作用，对热稳定，呈透明状，易于观察结果。

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂亚甲基双丙烯酰胺（简

称Bis）在催化剂的作用下，聚合交联而成的含有酰化胺基侧链的脂肪族大分子

化合物。

三实验器材

1、血清及其他蛋白质样品。

2、移液器。

3、稳压直流电源（500V）。

4、玻璃管0.5cm×7-10cm(×10)。

5、灯泡瓶。

6、注射器10ml(×1)。

7、滴管。

8、培养皿10cm(×5)。

9、圆盘电泳槽。

10、量瓶25ml（×1）、10ml（×1）。

四实验试剂

1、1mol/LHCL。

2、丙烯酰胺（Acr）：

3、N，N，N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED):密封避光保存.可用N-二甲氨基丙腈

或三乙醇胺代替,但效果较差.

4、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(Bis):

5、三羧甲基氨基甲烷(简称Tris).

6、过硫酸铵(A.R)(聚合用催化剂)

7、0.05％氨基黑10B溶液:称取50mg溶于100ml水中.

8、冰醋酸.

9、0.05％溴酚蓝溶液:称取50mg溴酚蓝加水溶解并定容到100ml

10、40％蔗糖。

11、20％蔗糖-溴酚蓝溶液：100ml20％蔗糖溶液加50mg溴酚蓝

12、甘氨酸-Tris缓冲液：称取甘氨酸28.8mg，Tris0.6g加水定容至1000ml

（pH8.3）

13、1％考马斯亮蓝G250。

五实验方法

1、贮备液配置

A液－小孔胶缓冲液：1mol/LHCL12mlTris18.3gTEMED0.12ml用稀HCL

调PH至8.9，家水至50ml，混浊可过滤。

B液—大孔胶缓冲液：1mol/LHCL12mlTris1.5gTEMED0.12ml用

稀HCL调PH至6.7加水至25ml

C液－小孔胶单体溶液：丙烯酰胺７g亚甲基双丙烯酰胺0.184用25ml容量瓶容

定后过滤.

D液－大孔胶单体溶液:丙烯酰胺1g亚甲基双丙烯酰胺0.25g用10ml容量瓶容

定后过滤..

E液－40％蔗糖溶液.

F液－0.14％过硫酸铵溶液(要新配,试剂要好)

以上试剂需要放入冰箱保存,前四种溶液,配制后如超过两个月需要重新配制.尤

其是C,D两液,由于Acr及Tris容易水解生成丙稀酸和NH冷藏也只能保存1-2

3,

个月.如PH超过5.2,即失效.F液只能使用一个星期.否则,将延缓凝胶聚合.

2、准备好内径为0.5cm、７－１０cm长的玻璃，切口磨光，洗夜浸泡，洗净烘

干备用。

3、凝胶的制备：

（1）将所用的试剂从冰箱中取出，放至室温

（2）小孔胶（分离胶）制备：取一灯泡瓶按V（A）：V（C）：V（水）：V（F）=1：

2：1：3的比例混合，混合的溶液抽气（用水泵或油泵，约10min，除溶解氧），

然后用滴管将胶加入玻璃管内（玻璃管首先底部贴上胶布，放于有机玻璃试架上，

加40％蔗糖溶液少许，以使胶面底部平整），当加到玻璃高度2/3时在表面覆盖

一层水。25℃聚合30-60min，使之凝聚。吸取表面水分。

（3）大孔胶（浓缩胶）配制：取一灯泡瓶按V（B）：V（D）：V（E）：V（F）=1：

1.5：1：4的比例混合，抽气（同上）。加至分离胶面上约1cm高度，表面覆盖

一层水，聚合20-30min，除去表面水分。

4加样

取血清5ul，加于白瓷板凹穴内。用0.1ml20％蔗糖溴酚蓝液稀释。取50