固定化胰蛋白酶到多功能中间大孔核壳微球一个新的快速酶催化平台.pdfVIP

胰蛋白酶固定到多功能介孔核壳微球：快速酶催化的新平台

摘要

本研究通过将胰蛋白酶固定在多孔核壳FeO@fTiO微球上形成了一种简单、

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快速、有效和可重复使用的微波辅助胰蛋白酶消化系统。这种磁芯和二氧化钛壳纳米

结构具有多种孔径（2.4和15nm），高的孔隙体积（0.25cm3g−1）和大的比表面积（50.45

2−1

mg）。该系统可以实现蛋白质的快速、高效微波辅助胰蛋白酶消化。各种标准蛋

白质（细胞色素C（Cyt-c），肌红蛋白（MYO），β-乳球蛋白（β-LG）和牛血清白

蛋白（BSA））可以在微波辐射条件下45s内被消化，并能通过质谱（MS）有效地

鉴定分析；即使底物浓度低至5ngμL-1也可以测定。此外，45s微波辅助胰蛋白酶消

化系统在胰蛋白酶固定化微球重复使用5次后仍然有效。重要的是，来自10μg小鼠

脑蛋白的1715个特异蛋白质在经过45s微波辅助胰蛋白酶消化处理后，能够精确地

鉴定。

关键词：介孔；磁铁矿；二氧化钛；胰蛋白酶；消化；质谱法

一引言

蛋白质组学可以提供蛋白质表达变化的全面认识，从而对生物体的结构、功能和

调控进行细节描述。因为蛋白质组学侧重于研究从高度复杂的生物样品中提取出来的

蛋白质，以此获得蛋白表达变化的全面认识,这有助于促进个性化治疗[1-3]。酶作为

天然催化剂，在所得肽的质谱检测用于蛋白质的鉴定和翻译后修饰的调查之前，广泛

应用于蛋白水解消化中[4-6]。酶解是蛋白质组学中必要和关键一步，并且溶液和凝胶

中蛋白质的水解是常用的蛋白质水解方法[7,8]。然而，通常由于劳动强度大，样品损

失，酶的低稳定性，难回收，消化时间过长以及低浓度蛋白质的消化有限等使得酶解

的应用受到限制[9-11]。因此，发展一种快速有效的蛋白水解方法对于实际生物医学

中大规模的蛋白质组分析非常重要。

将酶固定在固体载体上，可以提高酶的稳定性和水解效率，同时也会促进产物分

离和酶的回收利用[12]。随着纳米技术的迅速发展，各种纳米结构被开发用于载体以

提高酶的稳定性和活性[13-17]。除了酶载体的组成，酶载体的结构在酶的固定化、酶

活性和酶效率中也起着重要的作用[18,19]。特别是，大孔介孔材料能够作为有效的载

体支载大量的酶，并能转运靶标生物分子[20-22]。尽管有了这些丰富的研究成果，许

多现有的酶载体仍然有一些缺点。例如，由于酶分子间缺乏特异的相互作用，而降低

了酶的活性和酶催化效率，所以必须进行繁琐复杂的预修饰作用[23]。此外，固定化

胰蛋白酶的再生几乎不可能实现，并且酶载体也不便于离心分离[24]。对于高生产量

的蛋白质组学来说，加速酶消化很迫切。因此，开发新型有效的酶固定化技术对于加

速和方便蛋白水解至关重要。

磁性微粒具有较好的磁响应性，在水中分散性好，良好的生物相容性和化学稳定

性的特点，它们已被广泛应用于各种生物分离过程中[25-27]。由于磁性核壳结构优良

的特性和对多个离散组分之间产生的协同作用，它们吸引了大量的研究关注。最近，

有研究证明，磁核和二氧化钛壳微球比纯FeO粒子具有更强的微波吸收性能[28]。

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微波辐射可以加速蛋白质的酶解[29,30]，而TiO材料基于其路易斯酸性质显示了对

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生物分子的高亲和力和高吸附能力[31-33]。因此，具有磁核和多孔二氧化钛壳的核壳

微球能够作为有效的酶固定化载体。应该指出的是，尽管在优化的试验条件下通过利

用TiO对磷酸肽的磷酸基团特殊的亲和作用，TiO可以作为磷酸肽浓缩的有效亲和

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材料（例如，低pH下的三氟乙酸控（2-3），通过其羧基的质子化防止非磷酸化肽的

非特异性结合；50-80%乙腈用于阻止