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β-淀粉酶活性的测定2013/05/10

1.原理

β-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化

酶。淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝

基水杨酸，其反应如下：

加热

还原糖糖酸

碱性

淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，

用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成

的麦芽糖的量来表示酶活力。

1unit:在pH4.8，20℃下3min内生成1mg麦芽糖时所消耗的酶的量。

计算方法：

麦芽糖换算量(mg/mL)3(定义上的酶反应时间)

β-淀粉酶活性度=

10(实际酶反应时间)×10(稀释倍数)

2.仪器设备

紫外分光光度计

恒温水浴锅

电炉

制冰机

离心机

振荡器

容量瓶：50ml×1、100ml×1

具塞刻度试管：15ml×8支

试管：8支

微量移液器

3.试剂和溶液

-1-

3.116mMsodiumacetatebuffer.pH4.8at20℃

称取醋酸钠68g溶于水，加醋酸28.6mL，用去离子水定容至1000mL，摇匀，即可。

3.21%可溶性淀粉溶液

称取1.0000g(精确度为0.001g)可溶性淀粉，加入80mL左右醋酸缓冲液(pH4.8)，在电

炉上加热溶解，冷却至室温，用缓冲溶液定容至100mL，过滤(Advantec)，备用。每次实验

时现场配制使用。

3.3DNS试剂(dinitrosalicylicacid,3,5－二硝基水杨酸，显色剂)

DNS试剂(Kfri法)DNS(Sigma法)

试剂名数量(g)数量(g)

DNS10DSN6.3

Rocellesalt(酒石酸钾钠)200Rocellesalt176

(sodiumpotassiumtartrate)

NaOH10NaOH9.4

Phenol2(1.87mL)先用D.W.溶解NaOH，然后一点一点加

入Rocellesalt溶解，待完全溶解之后，

NaSO0.05

222添加到DNS中。

总量1000mL1000mL

3.41%Maltose标准溶液

称取麦芽糖1.000克，溶于少量蒸馏水中，仔细移入容量瓶中，用蒸馏水定容到100ml，

即成10mg/mL麦芽糖溶液。

4.菌种培养及粗酶液的配制

4.1种子培养基培养

从平皿培养的培养基中用接种环挑起一菌落的菌种，接种在装有50mL无菌TSB培养基

的250mL三角瓶中，于37℃下恒温摇床培养16h，转速为150r/min，备用。

4.2菌