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血凝抑制试验

1.适用范围

本标准规定了禽流感的血凝试验、血凝抑制试验。

本标准适用于禽流感抗体的检测（主要适用于血清样品）。

2血凝试验

2.1材料与试剂

2.1.1器材：一般天平、分析天平、一般离心机、微型振荡器、

注射器、冰箱、高压灭菌器、微量移液器及96孔V形血凝反应板。

2.2.2pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)，配制方法参见附录A。

2.2.31%鸡红细胞悬液，配制方法参见附录B。

2.2.4阿氏液，配制方法参见附录C。

2.2.5标准禽流感病毒抗原，购入的标准禽流感病毒应检测其血

凝效价并进行无菌检验，以检查与所标HA效价是否相符。若不符，

应重复检测并到相关试验室验证。

2.2操作程序

A.取96孔V形微量反应板，用微量移液器在1~12孔每孔加25

LPBS，共滴8排，后四排的第1列孔再补加25LPBS。

B.吸取25L标准禽流感抗原加入到第1列孔中，吹打3~5次充

分混匀。

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C.从第1列孔吸取25L混匀后的抗原液加到第2列孔中，混匀

后吸取25L加入到第3列孔中，依次进行系列倍比稀释至第11列孔，

最终从第11列孔各吸取25L弃之，设第12列孔为红细胞对比。

D.自右向左依次向各孔加入25L1%的鸡红细胞悬液。

E.将反应板置于微量振荡器上振荡1min，室温（20-25℃）静

置45min后观看结果，若环境温度过高，可于4℃静置60min，红

细胞对比孔成明显的纽扣状沉到孔底时即可判定结果。

2.3结果判定

A.在红细胞对比孔消失正确结果的状况下，将反应板作45倾斜，

观看红细胞是否完全凝集。以完全凝集的病毒最大稀释度为该抗原

的血凝滴度。完全凝集的病毒的最高稀释倍数为1个血凝单位

（HAU）。

B.最终结果取2倍、3倍倍比稀释抗原的血凝滴度的几何平均值。

3血凝抑制试验

3.1材料与试剂

3.1.1器材：一般天平、分析天平、一般离心机、微型振荡器、

煮沸消毒器、冰箱、高压灭菌器、微量移液器及96孔V形血凝反应

板。

3.1.2pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)配制方法参见附录A。

3.1.31%鸡红细胞悬液配制方法参见附录B。

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3.1.4阿氏液，配制方法参见附录C。

3.1.54单位抗原，制备方法参见附录D。

3.1.6HA效价高于10log2时可连续增加稀释的孔数。

3.2操作程序

A.依据血凝试验结果配制4单位抗原。以能引起100%血凝的病

毒最高稀释倍数代表1个血凝单位，4单位抗原的的配制方法如下：

假设抗原的血凝滴度为1:256（28），则4单位抗原的稀释倍数应

是1:64（256除以4），稀释时，将1mL抗原加入到63mLPBS中

即为4单位抗原。但是该4单位抗原必需经过验证（如附录D4单

位抗原的标定）后才可确定其稀释倍数，用于血凝抑制效价的测定。

B.取96孔V形微量反应板，用移液器在第1~11孔各加入25L

PBS，第12孔加入50LPBS。

C.在第1孔加入25L被检血清，充分混匀后移出25L加至第2

孔，依次类推，倍比稀释至第10孔，第10孔弃去25L，设第11

孔为病毒对比，第12孔为红细胞对比。

D.在第1~11孔各加入25L4单位抗原，轻叩反应板，使反应物

混合匀称，室温20-25℃下静置30min。

E.自右向左依次向各孔加入25L1%的鸡红细胞悬液。

F.将反应板置于微量振荡器上振荡1min，室温（20-25℃）静

置40min后观看结果，若环境温度过高，可于4℃静置60min，红

细胞对比孔成明显的纽扣状沉到孔底时即可判定结果。

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