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第十八章全自动荧光定量PCR系统的原理和应用

引言

在过去的15年中,聚合酶链式反应(PCR)已经成为分子生物学研究领域中最重要的方法

之一。PCR在基因克隆、测序、mRNA分析、DNA和RNA定量、诱导突变、基因检测、个体鉴定方面

的应用都已得到开展，在诊断方面应用尤其广泛。而且自1985年问世后，PCR技术本身有了很大

的发展。特别是耐热聚合酶的发现、提高扩增特异性和控制污染方法的应用。由于PCR灵敏度

高、特异性好、操作方便，相继一些能够简化PCR产物检测的方案不断问世，这些技术包括微孔

板酶联免疫检测法、PCR－连接酶链式反应偶联技术、用色素嵌入进行动态检测分析以及用固定于

膜上的探针捕获扩增产物等。虽然生化技术改进使得检测方案有了长足进步，但由于定量PCR要

求严格，并且未做到产物检测自动化，从而成为临床医学应用的瓶颈。在1991年至1998年短短

的七年间研究开发定量PCR的文献增加了十倍，这是由于定量PCR在灵敏度方面比杂交方法高5

倍并具有10倍的动力学范围的优势，使得其成为基因诊断行业的发展趋势。市场上新推出的荧光

定量PCR系统如罗氏集团的LightCycler系统，以荧光技术配合超高速的热循环，能在20分钟内

完成扩增及分析。突破性PCR技术可使用户在同一管内同时作扩增和检测，在扩增进行的过程中

实时地分析样品。

对生物医学领域而言,无论是基础研究还是应用方面，PCR都起到了革命性推动作用。在

诊断遗传性疾患、检测临床标本中病原体的核酸序列、对法医学标本作遗传学鉴定，以及分析激

活癌基因中的突变情况等方面得到广泛应用。在最近三年以来，聚合酶链反应技术在遗传疾病DNA

诊断市场占优势，2000年的世界总销售额为3.941亿美元，到2005年可增长到大约6.066亿美

元。

实时定量PCR

PCR反应通常包括反应起始期，对数期（Log期）及平台期。当PCR产物的信号强于系统

的背景信号，对数期开始，反应效率降低时进入平台期。对数期的扩增可归结为以下公式：

n

Tn=To(E)

Tn表示在循环n时靶序列的数量，To表示靶序列的起始数量，E为扩增效率。扩增效率最大为2

（每个循环PCR产物复制一次），最小为1（相对于没有扩增）。对每个PCR反应而言，对数期开

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始的循环数与起始模板浓度正相关。如果你的PCR起始模板数为10，扩增效率为1.9，根据公式

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可预测出产生信号时在第14个循环上。如果起始模板数为10，，根据公式可预测出产生信号时

在第25个循环上。如果你使用单拷贝的基因扩增，则需要等待36个循环。这就是实时定量PCR

的基础。

荧光定量系统的工作原理（以LightCycler系统为例）

LightCycler温度的循环是通过交替注入系统热室的空气的温度变化而实现，升温是通

过加热线圈加热空气进行，降温通过室温空气流动而达到，其温度由热室内的热电偶所控制；以

此方法产生的实际温度，相对于已预设的温度只会有±0.3的偏差。热室内另设有一个电扇使其温

度均匀分布，确保所有毛细管都有相同的PVR温度；而常规的台式循环仪中导热块内的温度并不

均一。由于空气并无有效质量，因此该过程比使用常规台式或水浴式循环仪快得多，温度转变速

o

度可高达每秒20C，所以在数秒内热室便能达到预设的温度。

PCR反应容器为毛细管，由石英玻璃/塑料制成，并工艺性地在管底拉出一个小透镜。塑料

部分构成加样腔（最大体积20ul)，玻璃管部分构成反应腔(最大体积40ul)。提供的单盒包装有

96个毛细管（Rnasefree)，每个管子上面刻有编号（1－96〕，管盖和管子分开包装。由于

使用空气作迅速的热循环，以及毛细管具有很高的表面积/容积比例（确保空气和反应管之间的温

度迅速平衡），因此每个PCR循环的时间可降低至低于30秒，在20－30分钟内便可完成整个有

30－40个循环的PCR操作。毛细管由玻璃制成且管径均一，所以有合适的光学特性，使管