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荧光定量PCR手册

一、什么是荧光定量PCR

荧光定量PCR（QuantitativeRealtimePCR，qPCR）是一种在DNA

扩增反应中，通过荧光信号的实时监测来定量分析特定核酸序列的技

术。简单来说，它能告诉我们样本中特定基因的数量有多少。

这一技术在生物学、医学、农学等众多领域都发挥着重要作用。比

如，在医学诊断中，能检测病毒或细菌的感染量；在基因研究中，可

分析基因的表达水平。

二、荧光定量PCR的原理

荧光定量PCR的原理基于传统的PCR技术，但增加了荧光检测的

环节。

在PCR反应中，DNA会被不断复制。我们会在反应体系中加入一

种特殊的荧光探针或荧光染料。这些荧光物质的荧光强度会随着PCR

反应的进行而发生变化。

当PCR反应开始时，荧光信号很弱。随着反应的进行，DNA不断

扩增，荧光信号逐渐增强。通过检测荧光信号的强度变化，我们就能

实时了解PCR反应的进程，并计算出初始样本中目标DNA的含量。

三、荧光定量PCR的实验流程

（一）样本准备

首先，需要从待检测的生物样本（如血液、组织、细胞等）中提取

出DNA或RNA。提取的质量和纯度对后续实验结果至关重要。

（二）引物和探针设计

设计合适的引物和探针是关键步骤。引物是一小段能与目标DNA

序列特异性结合的寡核苷酸，它们决定了PCR反应扩增的区域。探针

则用于检测扩增产物，通常带有荧光标记。

（三）PCR反应体系配置

将提取的核酸模板、引物、探针、酶、缓冲液、dNTPs等试剂按照

一定的比例混合，配置成PCR反应体系。

（四）PCR反应

将配置好的反应体系放入荧光定量PCR仪中，设置好反应程序，

进行PCR反应。

（五）数据分析

PCR反应结束后，仪器会给出荧光信号的变化曲线。通过对这些曲

线进行分析，可以得出目标基因的初始含量。

四、荧光定量PCR的关键要素

（一）引物和探针的设计

引物和探针的特异性、长度、GC含量等都会影响PCR反应的效率

和特异性。一般来说，引物长度在18-25个碱基之间，GC含量在40%

－60%之间较为合适。

（二）反应体系的优化

包括酶的选择、dNTPs的浓度、镁离子浓度等。不同的反应条件可

能会导致不同的实验结果，需要进行优化和验证。

（三）荧光染料和探针的选择

常见的荧光染料有SYBRGreenI，它能与所有的双链DNA结合发

出荧光；而荧光探针如TaqMan探针、MolecularBeacon探针等则具有

更高的特异性。

（四）仪器的选择和使用

荧光定量PCR仪的性能和操作方法也会影响实验结果。需要选择

合适的仪器，并按照操作规程进行操作和维护。

五、荧光定量PCR的应用领域

（一）医学诊断

用于检测病原体（如新冠病毒、乙肝病毒等）的感染，判断疾病的

严重程度和治疗效果。

（二）基因表达分析

研究不同组织、细胞或生理状态下基因的表达水平，了解基因的功

能和调控机制。

（三）遗传疾病诊断

检测基因突变和染色体异常，辅助诊断遗传疾病。

（四）农业和畜牧业

检测农作物和家畜中的病原体、基因改良等。

（五）食品安全检测

检测食品中的致病菌、转基因成分等。

六、荧光定量PCR的优缺点

（一）优点

1、高灵敏度：能够检测到极微量的核酸。

2、高特异性：通过引物和探针的设计，能特异性地扩增目标序列。

3、定量准确：可以精确计算出目标核酸的初始含量。

4、快速高效：整个实验过程相对较短，能快速得到结果。

（二）缺点

1、成本较高：需要专门的仪器和试剂。

2、实验操作要求高：对样本处理、引物设计、反应条件等都有严

格要求。

3、容易出现污染：导致假阳性结果。

七、实验中的注意事项

（一）防止污染

操作过程中要严格遵守无菌操作原则，避免交叉污染。

（二）样本质量控制

确保样本的采集、保存和处理方法正确，以保证样本质量